第11卷　第6期大　学　化　学1996年12月海洋微生物活性代谢产物化学
林永成　周世宁　乐长高
(中山大学化学系　广州510275)
  摘要　90年代以来，海洋微生物代谢产物的研究取得了很大的进展；从微生物中分离到不少
结构新奇、有特殊生物活性和有潜在实用意义的新化合物，发现了一些不寻常的生源合成过程。海
洋微生物被认为是21世纪生物活性物质的新源泉。
一　海洋微生物代谢物的研究意义
  1.　微生物对化学和药物学科的发展起着极其重要的作用
  自从1929年发现微生物产生青霉素以来，已证明细菌和真菌是结构奇特的生物活性物质的丰富源泉。在过去60多年中，已经从微生物中发现了30000—50000种天然产物，其中10000多种有生物活性,8000多种是抗菌和抗肿瘤剂[1-2]。就人们熟知的抗生素而言，迄今通过发酵法生产的产品就有100多种，通过半合成法生产的有50多种。全球抗生素年产量超过100000吨，产值为50亿美元。这些药物抵抗着人类
多种严重危害生命的疾病，包括肿瘤疾病。抗生素类药物不但是人类健康的捍卫者，对这些抗生素化学结构与药效关系的研究，它们的合成研究，已推动了有机化学的发展。
  从陆地微生物中探查筛选天然药物的工作一直未停止过，此工作估计每年耗资90亿美元。然而发现新的代谢产物的速度正在减小，目前分离到的所有微生物代谢产物大部分是已知化合物。另一方面，传染性病菌对传统抗生素的抗药性正在迅速发展。过去几十年曾一度被控制住的一些疾病，又开始蔓延。病是一个例子。1993年世界卫生组织(WHO)宣布全球处于紧急状态，此种病每年夺去三百万人的生命。据报道目前有12种重要病菌有抗药性。令人更担忧的是：一些本来属于一般性的细菌感染，由于抗生素不能控制而最终可能成为严重疾病。故此寻天然生物活性产物的新源泉成了当务之急。近几年，科学家已注意到了另一个极有前景的药物新来源，这就是海洋微生物。
  2.　海洋微生物是新的生物活性物质的源泉
  海洋占地球表面积70%，海洋微生物无论从数量上或是多样性方面都是很大的。最近美国科学家发现一些地方，每平方英尺的海泥上就能到十多种尚未认识的新生物。
  海洋微生物生活在特殊环境之中，例如高盐度、高压、低营养、低温(特别是深海)或局部高温和无光照以及不同的生物之间的关系等等。在这些所谓生命的极限环境中，海洋微生物已发展出独特的代谢方式，这不仅确保其在极端环境中生存，也提供了在陆地微生物中未遇到过的
国家自然科学基金、广东省自然科学基金、华南生物工程基金和中山大学基金资助项目
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代谢产物的生产潜力，因而是多种多样新颖化合物的极好资源。科技界相信：海洋微生物将成为21世纪开发新型医药品的资源。
  海洋微生物的研究可追溯到本世纪40年代。当时Zobell等发现了海水的杀菌作用，稍后,Grein和Meyers发表了海洋放线菌产生抗生素的报告。虽然已有这些研究工作，但是对海洋微生物天然产物的研究仍然没有受到很多的注意。那时普遍认为，分离和培养海洋细菌是极端困难的。然而随着研究的发展，人们对海洋微生物的分离和培养的知识越来越多，直到80年代，对海洋细菌活性天然产物的研究有了较快的发展，近二三年，连续发表了多篇关于这一研究的综述，可见这一领域引起了各国科学家的重视。
  南海属热带和亚热带海洋，海洋微生物资源特别丰富。近年来，中山大学化学和微生物学工作者组成了南海海洋微生物研究组，开展了海洋微生物活性物质的研究。已从南海海水、海泥和珊瑚中分离到一些细菌和真菌，研究它们的代谢产物，取得了初步成果。
二　海洋微生物的分布、分离和培养
  海洋微生物与陆地的一样，也分为细菌和真菌，细菌中又可分为革兰氏阴性菌和阳性菌。  海洋微生物生存在海水和海泥中，种的密度随海洋环境，季节以及海的深度而变化。海底污泥的种密度一般比海水高，近岸的比大洋的密度高，在海藻大量繁殖的特殊近岸区域微生物的种数量高，这说明近岸区域更适合于各种生物生长，且受含有大量微生物的陆地环境的极大影响，因而可见到海洋微生物和陆地微生物。海洋动植物的表面和体内组织也都附生或共生着大量微生物。例如海绵的微生物特别丰富，估计共生的微生物占海绵体积的40%。深海环境中可以到一些稀有的微生物，其中一部分如嗜压细菌和耐温细菌等。
  所有用于分离陆地微生物的方法几乎都可用于海洋微生物的分离。但是有些海洋微生物的分离需要特殊条件，如需含有海水的培养基和调节水压；深海微生物需在高的静水压下从深海中分离出来等。
  至今，人们对于海洋菌的营养要求、生长因子及海洋丰富的有机物、无机物对生长的影响等知道得甚少。要进行生产性开发海洋微生物仍需加强这方面的基础研究。
三　海洋微生物代谢产物的提取分离
  用于其它生物的代谢产物提取分离的现代方法，都可用于海洋微生物的研究。例如溶剂萃取，重结晶和各种谱方法，包括HPLC和GC等。
  然而，海洋微生物代谢产物的提取分离最大特点是处理非常稀的水溶液。大部分有意义的代谢产物都是微生物的分泌物，存在于培养液中，其浓度很稀。有些代谢产物在每升培养液中含量不到0.2m g。例如从海洋细菌分离出的抗生素urauchimycins A和B,2升培养液只分离出A0.3m g,B1m g。如何从大量的含各种培养物质和盐份的海水中提取出所需的微量代谢产物成了研究工作的关键问题。
  迄今从细菌培养液中提取代谢产物一般有三种方法。其一是溶剂萃取，通常用乙酸乙酯萃取脂溶性代谢物。例如前述的urauchim ycins A(1)和B(2)就是采用此法。这一方法需要大量的有机溶剂，最后配合HPLC分离微量成份。其二是使用吸附剂，例如allem icidin(13)的提取[11]，首先用Hyflo Super-cel过滤，然后用活性炭柱吸附，用水洗活性碳柱后，用盐酸丙酮洗脱活性成分，再进一步用谱分离纯化。这两种方法都可避免处理大量的水。其三是浓缩水溶2
液，或者使用真空冷冻干燥除水，真空蒸发或薄膜蒸发除水，再提取分离，这一方法工作量颇大，耗时较多。
  由于海洋微生物代谢物化学性质的多样性，必须根据具体情况采取不同的提取方法。
四　海洋微生物中的生物活性物质
  最早报道的海洋细菌代谢产物是具有很好抗菌作用的吡咯化合物(3)，它是由Burkho lder 等1966年从
海藻表面分离的细菌中获得的[3]。该化合物被高度溴化，含溴量达70%，这在陆地生物，甚至在其它海洋生物中也是罕见的。这类独特的化合物的发现揭示了海洋细菌具有把溴引进有机化合物的高度能力。后来Faulkner研究组等也分离到类似的抗菌物质(4)和(5)[4]。
    (1)R=CH2CH(CH3)C2H5
    (2)R=C2H4CH(CH3)2
  日本To ky o研究组从近海海泥分离到的链霉菌str epto myces griseus SS-20分离到一些更加不寻常的化合物aplasmomy cins A-C(6)[5]，这些化合物在分子络合中心出乎意料地含有硼。其分子结构是一对称的环，中心为硼原子，成链呈冠醚状结构。该化合物有离子载体性质。
      　aplasm om ycin A,R=R′=H
    　aplasm om ycin B,R=H,R′=Ac      aplasm om ycin C,R=R′=Ac
  这种化合物能抑制包括分枝细菌在内的革兰氏阳性细菌，更引人注目的是它抗疟病的活性。给感染了疟原虫(plasm odium)的小鼠口服后可使含疟原虫的红细胞大量减少，所有经过的小鼠均存活，与此相反，未经的小鼠在8天内死亡，死前体内一半以上的红细胞发现有疟原虫，鉴于该化合物的抗疟作用而被命名为aplasmom ycin。
  已测定这些化合物的离子选择性为Rb+>K+>Cs+～Na+>Li+，没发现对二价离子的亲合力。aplasm omy cin A和aplasmom ycin B催化K+转移程度几乎相同，而aplasmo mycin C和脱硼的aplasmo mycin不能转移K+，这与它们的抗菌能力非常相符,aplasmom ycin的抗菌活性几乎等于aplasmomy cin B，而C比aplasm omycin弱，脱硼aplasmom ycin又比C弱。最近发
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现C的结构比原来观察到的更加复杂，通过NM R和X-射线方法，发现是以几种谱上稳定的构象存在的[6]。
  从日本海深3300米的海泥得到的海洋细菌alter omonas haloplanktis SB-1123分出一种非常有意义的新的22元环铁离子载体化合物,bisucaberin(7)[7]。(7)具有非常独特的生物学
性质，它能诱导小鼠腹膜巨噬细胞的强烈溶解肿瘤细胞的作用。这一性质已被提议在癌症化疗中用来研究利用自然免疫学方法代替使用强烈的细胞毒素。在同属的另种细菌A.luleovio-lacea中分离到两种新的铁离子载体altero bactins A(8)和B(9)。它们是肽类化合物，具有异乎寻常的对铁离子的亲和力K a=1049～1053![8]caber
  海洋微生物代谢产物的另一特是产生很多结构奇特的大环内酯化合物。macrolactins (10)是从深海(-1000m)细菌分离到的一组抗菌抗肿瘤抗病毒化合物。是罕见的24元环内酯[9]，含有六对两两共轭的烯键，其中macrolatin A，不但有抗菌作用，而且在体外有显著抑制B16-F10黑素瘤细胞活性(IC50=3.5 g/ml)，更为重要的是macrolactin A能抑制几种病毒，包括H erpes Simplex(IC50=  5.0 g/ml)和人免疫缺损病毒HIV(IC50=10 g/ml)。
　(10)M acrolactin
  最近从真菌中又分离到几种异常的大环内酯。如madur alide(11)，它是由美国加州Bode-ga湾浅海沉积物发现的细菌培养液分离得到的，也是24元环内酯，含有一个糖基[10]。
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  放线菌是陆地土壤细菌中有意义的代谢产物最重要的源泉，氰霉素、链霉素等都是从放线菌得到。迄今，从陆地土壤中发现的金霉素链霉菌还未在海洋中到，显然有些陆地放线菌不适于在咸的海水中生长。在海洋中有一些新的放线菌种存在着独特的代谢产物。有些与陆地微生物同种的海洋微生物，由于适应海洋环境而有某些差异，也可提供不同于陆地微生物的新的代谢产物。
  istam ycin是从海洋一种新的放线菌分离到的一种新的抗生素，是一种氨基糖甙化合物(12)。这些化合物对革兰氏阳性和阴性细菌包括那些对原有的氨基糖甙抗生素有抗性的菌都有极强的作用,MIC值0.1～3.0 g/m l，很有可能成为临床上抗感染药物。
  最近，从放线菌中strepto myces sioyaensis SA-1758分离到结构非常新颖、含硫和氮的生物碱altemicidin(13)[11]，其生源合成还未弄清，它具有单萜骨架，表明它可能经甲羟戊酸路线产生的。这个化合物显示强的体外抗L1210鼠性淋巴白血病和IMC癌细胞,IC50分别为0.84和0.82 g/ml，它的抗菌性弱，但毒性较大。
  除了从海洋微生物直接分离到很多有意义的代谢产物外，一个重要的成果是发现过去从其它海洋生物分离得到的有强生物活性的珍奇的化合物，例如河豚毒素、海葵毒素、壳鱼毒素和石房蛤毒素等都是由海洋微生物产生的。因为微生物比较容易大规模发酵培养，因此这些物质的大量工业化生产有了希望。
  然而值得重视的是对与海洋动植物共生的和附生的微生物的研究，不但对寻新的抗菌药有意义，而且可能对海产养殖业方面有重大作用。
  美国科学家在研究一种虾抗病性时，发现这些虾的卵具有有意义的表面细菌。当用抗生素处理除去这些细菌时，导致这些卵被一种致病真菌迅速感染。显然，是表
面的细菌产生了抗真菌物质保护了虾卵。通过培养和发酵细菌，分离出
一种意外地强的抗真菌物质,2,3-吲哚啉二酮(14)。虽然这是一种已知
合成化合物，它具有抗真菌活性还是第一次被发现。对美国龙虾同样的
研究也得到相类似的结果。用扫描电子显微镜发现龙虾卵上被一种单细
胞菌完全盖住。从这种细菌中分离出了大量2-对羟基苯基乙醇，它能有
效地控制致病微生物对虾卵的侵食[12]。
  最近从一种未鉴定的哩鱼身体表面也发现一种放线菌str epto myces sp.，它产生两种奇特的肽类化合物,salinam ide A(15)和B(16)，具有新的内酯环肽骨架。两种化合物有中等
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