中国医科大学
硕士学位论文
DNA错配修复基因缺陷的MSI-H大肠癌频发Ki-ras基因点突变
姓名：***
申请学位级别：硕士
专业：肿瘤学
指导教师：***
20050301
中国医科大学研究生学位论文独创性声明
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已在论文中作了明确的说明并表示谢意．申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任．
论文作者簦右：七乞
日期：
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论文作者签名：
指导教师签名：
痧爱
ＤＮＡ错配修复基因缺陷的ＭＳＩ—Ｈ大肠癌
频发Ｋｉ—ｒａｓ基因点突变
目的cari
肿瘤的发生是一个细胞遗传学逐渐失去稳定性的过程。调控基本生命活动的基因受到影响，最终细胞生长失去控制而发生转化。自然突变率导致的突变不能在个体一生的时间内引发这样大规模的变化，癌症的发生需要细胞首先获得突变表型。维护细胞遗传信息稳定性的机制非常复杂。其中最为重要的有ＤＮＡ错配修复系统，聚合酶的校对功能以及氧化损伤的移除。它们分别或协同对不同机制导致的ＤＮＡ损伤予以修复。这些机制的缺陷将导致突变表型的出现。
微卫星是大量存在于基因之间的１—５碱基的重复序列。在ＤＮＡ复制过程该部位容易发生聚合酶滑动引起微卫星座位的延长或缩短。ＤＮＡ错配修复系统可以识别并修复这种错误，对维持微卫星长度稳定相当重要。微卫星不稳定性可间接反映ＤＮＡ错配修复系统功能的缺陷。
各家报道微卫星检测技术及检出结果差异悬殊。此差异可能部分源于检测方法的不同。一种双荧光标志激光扫描自动片断分析法使微卫星不稳定性分析达到高精度高重复性的要求。通过该方法更可观测到微卫星不稳定性的详尽特征。
Ｋｉ—ｒａｓ突变是在大肠癌较常见的现象。Ｋｉ—ｒａ８变异热点１２号密码子的多种突变均可不同程度的导致细胞转化，细胞获得生长优势终致癌变。本试验拟通过１２号密码子突变谱反映基因组中的大量突变现象，并分析其与微卫星不稳定性相关性。本研究旨在揭示微卫星不稳定性的本质和起源。以及ＤＮＡ错配修复缺陷对大肠癌发生的影响。
材料与方法
１．实验对象
日本九州大学大学院医学研究院消化道综合外科１９９７—１９９８年连续病例７７例作为实验对象。大肠癌手术切除标本已建立癌组织及癌旁非癌组织ＤＮＡ库。本组病例男性４４名，女性３３名。年龄１５—６８岁，平均年龄６２．４岁。
２．主要试剂
Ｅ】（一Ｔａｑ聚合酶、Ｔａｑ聚合酶、合成ＰＣＲ引物、测序引物、荧光标识引物及ＰＣＲ反应及提纯相关试剂（日本Ｔａｋａｒａ公司）
测序ＰＣＲＢｉｇｄｙｅＶｅｒｓｉｏｎ１．０及ＴＳ（ＴｅｍｐｌａｔｅＳｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）试剂（美国ＡＢＩ，ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ公司）
Ｍｉｅｒｏｐｕｒｅ—ＥＺＥｎｚｙｍｅＲｅｍｏｖｅｒ柱，Ｍｉｃｒｏｃｏｎ—ＰＣＲ柱，ＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ一１００柱（美国Ｍｉｃｒｏｐｏｒｅ公司）
ＰＲＩＮＣＥＴＯＮＣＥＮＴＲＩ—ＳＥＰ柱（美国ＡＢＩ公司）
３．实验方法
１）ＨＲＦＭＡ法测定大肠癌微卫星不稳定性。
２）ＰＣＲ扩增鼬一ｒａ８第一外显子１２，１３密码子为中心的碱基序列。２种引物直接测序法Ｋｉ—ｒａｓ１２，１３密码子部位测序。
３）ＭＳＩ—Ｉ－Ｉ大肠癌的ｈＭＬＨｌ和ｈＭＳＨ２基因全长测序。
４）统计分析卡方检验及Ｆｉｓｈｅｒ精确校验。
结果
ｌ、７７例中检出１３例（１６．９％）ＭＳＩ—Ｈ，１８例（２３．４％）ＭＳＩ—Ｌ及４６例（５９．７％）ＭＳｓ。
２、检出２２（２８．６％）倒Ｋｉ—ｒａｓ１２，１３号密码子突变，其中１５（６８．２％）例为１２号密码子突变。酝一ｒａｓ突变率在３种微卫星状态的分布无显著性差异。微卫星不稳定大肠癌ｌ（ｉ—ｒａａ１２号密码子的突变多数（７／８，８７．５％）为转换。微卫星稳定大肠癌磁一ｒａｆｔ１２号密码子突变中颠换占多数（６／７，８５。７％）。此差异在统计学有显著性意义。
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３、ＭＳＩ—Ｈ中检出ｈＭＬＨｌ和ｈＭＳＨ２突变的肿瘤ＭＳＩ波型独特。ＭＳＩ—Ｈ肿瘤中Ｋｉ一瑚突变均检出于具备此类型波型的病例。
结论
１．Ｋｉ—ｌ＂／ｍ１２和１３号密码子突变率在ＭＳＩ—Ｈ，ＭＳＩ—Ｌ及ＭＳＳ大肠癌间无显著差异。
２．微卫星不稳定性大肠癌中检出的Ｋｉ—ｍ突变谱多为转换突变。这从一个方面证明了ＤＮＡ错配修复缺陷与微卫星不稳定性及点突变率提升的相关。
３．ＭＳＩ—Ｈ大肠癌中检出一种小于６个碱基的ＭＳＩ变化。该变化与ｌ（ｉ一强ｓ突变及ＤＮＡ错配修复关键基因的突变相关。提示此种变化同ＤＮＡ错配修复可能存在相关性。
关键词：大肠癌；Ｐｔａｓ基因；微卫星不稳定性；ＤＮＡ错配修复；突变
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