文章编号
一种双歧杆菌鉴别计数培养基的研制
居建华1，徐万军1，陈　敏2
(1.上海市疾病预防控制中心，上海200031;2.上海市卫生局卫生监督所，上海200336)
  摘要:　目的　研制一种双歧杆菌鉴别计数培养基。方法　研制的改良M RS培养基补
充了双歧杆菌和乳酸菌需要的特殊营养成分，并依据大多数双歧杆菌具有半乳糖苷酶能特
异性水解含半乳糖低聚糖的特征，加入5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖物质，作为
底物，使双歧杆菌水解底物释放出吲哚，产生颜反应。结果　双歧杆菌菌落呈蓝，乳酸菌
一般为白或淡蓝。结论　改良M RS培养基上的双歧杆菌和乳酸菌菌落有明显的鉴别
性，适用于双岐杆菌和乳酸菌联合制剂的菌落计数。
关键词：改良M RS培养基;X—Gal；鉴别计数.
中图分类号:R378    文献标识码:A
  近年来，我国出现了许多含双歧杆菌和其他益生菌的活菌制剂，有药品、口服保健液和乳制品等。据文献报道，在含双歧杆菌的食品制剂中，只有当双歧杆菌活菌数达到106CF U/ml以上，才能发挥正常的生理保健功能[1]。由此，制剂中的双歧杆菌的含量直接关系到产品的质量，对其计数也就成为至关重要的工作。目前市场上含双歧杆菌的益生菌制剂，大多由两种以上的益生菌组成，并以双歧杆菌和乳酸菌联合使用为多。在通常使用的BBL琼脂、BL琼脂和T PY 琼脂上，这两种生长特点相近的益生菌很难区分，给双歧杆菌的计数带来了困难。我们参阅了国内外有关文献[2,3]，对传统的双歧杆菌、乳酸菌培养基进行了改良，研制了一种双歧杆菌鉴别计数培养基(改良M RS)：根据双歧杆菌半乳糖苷酶活性较高的特点，加入5-溴4-氯3-吲哚β-D-半乳糖苷(5-bro mo-4-chlo ro-3-indo ly l-β-D-g alactopy ranoside，以下简称X-Cal)，使其底物分解，呈现蓝的双歧杆菌菌落，具有良好的鉴别性。现将此培养介绍如下:
1.材料与方法
1.1　实验材料
1.1.1　菌种来源　达能高钙特浓酸奶(上海达能酸乳酪有限公司，生产日期2000-05-02)，以下简称达能高钙。　康福陪胶囊(上海信谊营养保健品厂，生产日期2000-03-01)，以下简称康福陪。益生宝BF胶囊(华东理工大学生化工程研究所，生产日期2000-06-01)，以下简称益生宝。双金爱生微生态胶囊(上海双金生物科技有限公司，生产日期1999-12-01)，以下简称双金爱生。
1.1.2　实验材料　疱肉培养基[6];M C培养基[5];BBL琼脂[7]；改良M RS培养基配方：胰蛋白胨(英力OXO I D)0.5g，植物胨(英国OX O ID0.5g)示蛋白胨(英国O XO ID0.5g)酵母浸出粉(英国OX O ID0.5g)葡萄糖(CP，上海1.5g)乳糖(CP，上海0.5g)5%半胱氨酸(CP，上海1.0ml)吐温-80 (CP，上海0.1ml)氯化镁(CP，上海0.05g)柠檬酸铁铵(CP，上海0.2g)硫酸锰(C P，上海0.005g)乙酸钠(CP，上海0.5g) X-Gal(美国PRO M O G A6mg)琼脂粉(浙江洞头1.4g)无水磷酸氢二钠(CP，上海0.2g)去离子水(上海计量技术研究所100ml)p H6.4±0.2。
1.2　方法
1.2.1　菌悬液的制备　取达能高钙1ml，康福陪1粒，益生宝1粒；双金爱生1粒分别加入疱肉培养基经37℃48h培养后，用无菌生理盐水稀释至10-4，备用。
1.2.2　接种和培养　平皿涂布接种，取10-4各样品菌悬液0.2ml分别滴入M C琼脂、BBL琼脂、改良M RS琼脂平皿上，分别接种于3个平皿，并以L棒涂布均匀。M C琼脂置于37℃培养箱培养48h直接计数；
其余两种平皿置于厌氧培养罐(法国生物梅里埃公司提供)37℃培养48h，再置于含氧环境培养6h后分别计数。用此培养方法，有利改良M RS琼脂平皿上双歧杆菌菌落显。
2　结　果
每份检样同时采用3种培养基进行计数培养。从表Ⅰ的结果来看，通过改良M RS琼脂和BBL琼脂的比较，证实改良M RS琼脂上的双歧杆菌和乳酸菌有良好的鉴别性且细菌的生长良好：改良M RS琼脂上的菌落数(蓝菌落数+白菌落数)均不低于BBL琼脂上的菌落数，且改良M RS 琼脂能够将双歧杆菌(蓝菌落)与乳酸菌(白菌落)明显地区分，益生宝样品中因不含乳酸菌，使整个平皿上均呈蓝菌落。通过与M C琼脂比较，证实乳酸菌在改良M RS琼脂上生长基本上不受影响：除康福陪二号平皿外，其余均与M C琼脂的菌落数大致相等。
表Ⅰ　改良M R S琼脂、BBL琼脂、
M C琼脂菌落计数实验结果的比较
改良M RS
琼脂菌落数
BBL琼脂
菌落数
M C琼脂
菌落数
一二三
cari蓝白蓝白蓝白
一二三一二三达能高钙17683152246107381507154康福陪8561231744912025104372932益生宝790620750715068413539双金爱生67334820720103827127250
3　讨　论
3.1已经证实短双歧杆菌、长双歧杆菌及两歧双歧杆菌含有半乳糖水解酶Ⅰ(β-Ga l)，它能特异性水解含半乳糖的低聚糖。又有报道25种双歧杆菌90%以上对半乳糖呈阳性反
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其致龋性。G T F催化蔗糖合成细胞外葡聚糖是一种重要致龋性毒力因子，是形成牙菌斑，致牙齿脱矿，
发生龋病的物质基础，检测G IF酶的活性是判断细菌致龋力的重要指标。本实验所使用的含氟矿化液使S.mutans和S.Sobrinus所产生的GT F酶活性明显减低，这与矿化液中有一定量的氟离子密切相关。一方面，氟可直接或间接地作用于细菌的胞壁，当菌细胞内所摄入氟达到一定浓度时，抑制细胞内酶的活性[3]；另一方面，氟离子进入菌细胞内，与其他离子结合形成难溶的化合物，从而抑制酶的活性[4]。有关氟化物对细菌胞外葡糖基转移酶影响的研究颇多，结果不一致。多数报道认为10～70ppm氟离子浓度可使变链菌胞外多糖减少，而有的却认为低浓度氟离子浓度能增加变链菌胞多糖的形成[5]。Shklain[6]认为100ppm氟离子浓度的氟化钠不能抑制变链菌产生细胞外多糖；本研究结果显示氟微量元素矿化液抑制G T F酶活性的作用比单氟矿化液——含氟矿化液的作用更强，故推测氟微量元素矿化液的抑制作用不能只归结于氟离子，还与锡、锌等微量元素的存在密切相关。锡、锌等微量元素被细菌吸收，干扰了膜的转运机制，抑制细菌的生长及产酸，从而抑制G T F酶的活性[7,8]。
3.2　矿化液对LD H的影响　乳酸脱氢酶(LD H)在牙菌斑的糖代谢中占十分重要的位置，主要经已糖二磷酸(EM P)途径，是这一代谢过程中的重要酶，是M S毒力因子之一。它的活性取决于1,6-二磷酸果糖的存在，在外源性糖丰富时，乳酸脱氢酶被活化,90%以上的葡萄糖可转化为乳酸。在外源性糖缺乏时，乳酸脱氢酶被抑制[9]；通过L DH的催化作用，菌斑中丙酮酸和乳酸相互转化，减少乳酸在菌斑中的堆积[10,11]。因此,L D H在调节菌斑的生态平衡和酸代谢中起重要作用。缺乏LD H(LD H-)的M S突变株产酸量少，与野生株相比，在体外和啮齿动物模型中的致龋力却显著下降。LD H总是以高浓度存
在于细胞内，但也分泌于牙菌斑中[12]。通过直接测定菌体悬液可分析其活性。本研究结果显示无氟矿化液和含氟矿化液对S.mutans和S.Sobrinus所产生的
LD H的活性无明显的抑制作用，而氟微量元素矿化液有抑制LD H活性的作用，是其防龋作用的主要途径之一。
综上，氟微量元素矿化液对GT F和LD H有明显的抑制作用，其抑制作用是抗变形链球菌致龋作用的主要途径之一，为氟微量元素矿化液对细菌的作用机理提供实验室依据。
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(上接第291页)
应[1]。根据这个原理在双歧杆菌的基础培养基中加入X-Gal 物质，作为底物，则半乳糖苷酶可分解底物，释放出吲哚。当在改良M RS琼脂中加入6mg/100ml X-Ga l时，平皿上双歧杆菌菌落呈蓝，乳酸菌一般为白或淡蓝[2]。
3.2有文献报道，长双歧杆菌半乳糖苷酶在M n2+的条件下可被少量激活，故在改良M RS培养基中加入适量的硫酸锰。3.3改良M RS琼脂与BBL琼脂、M C琼脂比较，前者能明显鉴别双歧杆菌和乳酸菌，方便了菌落计数工作。对于规范含双歧杆菌和乳酸菌的保建食品市场和保护广大消费者利益具有重大意义。
3.4由于时间仓促，得到的样品数量不大，数据难以使用统计学方法进行评估。另外，双歧杆菌一定种类的标准菌株试验和加入适量抗生素以提高选择性的试验也未开展。这些工作均有待我们今后的研究和探讨。
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[6]中华人民共和国国家标准.GB478928-84.
[7]双歧杆菌检验方法GB讨论稿附录A：专用培养基及试剂.
294中国微生态学杂志　2000年10月第12卷第5期　Chines e J ournal of M icroecology,October2000,Vol12No5

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