第二军医大学
硕士学位论文
体外建立CD4+记忆性T细胞生成模型和分子机制的初探
姓名：***
申请学位级别：硕士
专业：免疫学
指导教师：***
2011-06
体外建立CD4+记忆性T细胞生成模型和分子机制的初探
摘要
免疫记忆性是机体对外界病原体最有效的抵抗机理，可保证机体再次遇到同一病原体时迅速启动免疫防
御机理消灭病原体，也是疫苗作用的物质基础。免疫记忆系统由体液免疫记忆和细胞免疫记忆两部分构成，承担体液免疫系统记忆功能的为记忆性B细胞(memory B cells,Bm)，承担细胞免疫系统记忆功能的为记忆性T细胞(memory T cells,Tm)。人Tm的特征性表面标志是CD45RO+，在小鼠体内根据其归巢部位的不同和表达趋化因子受体不同，Tm分为效应型记忆性T细胞(CD44+CD62L-CCR7-)和中枢型记忆性T细胞(CD44+CD62L+CCR7+)。对于记忆T细胞来源存在线性(或定向)分化和非线性(或不对称)分化两种模式。线性分化模式认为：初始T细胞先分化为能分泌细胞因子的效应细胞，然后其中很少的一部分转化为记忆细胞。另一种观点认为Tm来源于一类较迟到达免疫应答晚期阶段的前体细胞。非线性分化模式则认为一部分活化的初始T细胞不经过效应T细胞阶段直接分化为记忆细胞。最近的研究表明，记忆细胞的来源更倾向于线性分化模式。
体内研究证明，与CD8+T细胞不同，IL-7对CD4+Tm的形成起了至关重要的作用。IL-7-/-小鼠和IL-7R表达突变的小鼠在抗原刺激后不能形成CD4+Tm。在CD4+T 细胞反应性增殖的高峰期增强IL-7信号，可以促进TCR转基因小鼠的效应CD4+T 细胞增殖以及上调Bcl-2的表达，阻止其在收缩期死亡，从而增加CD4+Tm。在T细胞收缩期注入IL-2,IL-7或IL-15都可以使CD8+T细胞收缩期减缓。在收缩期体内注入IL-2 或IL-15 后，主要积聚的是KLRG1hi CD127lo的短期存活效应和记忆细胞，而注入IL-7则主要积聚KLRG1lo CD127hi的长期存活记忆细胞。但体内研究只能证明细胞因子对CD4+Tm分化的影响，并不能了解诱导CD4+Tm分化的分子机理。因此人们将CD4+Tm分离出来，研究CD4+Tm自稳性存活
和再刺激后增殖的分子机理。研究的靶细胞主要有两类：小鼠自发分化的记忆表型T细胞和抗原特异性T细胞。在正常生理条件下，两类CD4+Tm的自稳均需要IL-7和IL-15。记忆表型CD4+Tm的快速增殖还需要MHC-II类分子，抗原特异性CD4+Tm的快速增殖不需要MHC-II类分子而主要依赖IL-7。IL-7R高表达于静息T细胞，当T细胞被激活后，IL-7Ra (CD127)迅速下调，仅少数可转化为Tm的效应细胞再次表达IL-7Ra。在CD8+T细胞已经证明，IL-7Ra的表达对检测记忆细胞前体很有作用。
鉴于目前对CD4+Tm分化主要是体内研究，尚无体外模型。为了能深入研究CD4+ Tm分化的机理，我们拟首先以流式细胞仪检测CD44和 CD62L表达作为指标，用IL-7刺激建立体外诱导CD4+Tm生成的模型；然后用不同细胞因子或细胞因子组合
- 1 -
第二军医大学硕士学位论文
刺激，观察其诱导CD4+Tm生成的能力；再通过CFSE标记和抗原再刺激验证体外增殖的细胞确为CD4+Tm；最后以实时荧光定量RT-PCR和Western-blotting等检测探讨CD4+Tm形成的分子机制。
第一部分  体外建立CD4+Tm生成模型
目的：最初考虑用OT-II小鼠CD4+T细胞来建立本模型。但由于OT-II小鼠饲养困难，数量不足，所以拟
以FBS作为抗原，用野生型C57BL/6小鼠CD4+T细胞来建立本模型，并与OV A刺激的OT-II小鼠CD4+T细胞比较，证明本模型的实用性。用抗原处理的DC和IL-7在体外刺激初始CD4+T细胞，在不同时间检测T细胞表达CD44和CD62L的情况和再次抗原刺激增殖情况，建立体外诱导CD4+Tm生成的模型，为探讨体外诱导CD 4+Tm生成的条件打下基础。方法：无菌条件下分别取OT-II 和C57BL/6的股骨和胫骨，提取骨髓细胞在体外分别用FBS或OV A刺激，加入IL-4 (1ng/ml)和GM-CSF(10ng/ml)诱导骨髓来源的成熟DC(mature dendritic cell, OV A-DC
或FBS-DC)。无菌条件下分别取OT-II和C57BL/6小鼠脾脏，分离单个核细胞，磁珠分选CD4+T细胞；将OV A-DC与OT-II CD4+T细胞1:10混合，FBS-DC与C57BL/6 CD4+T细胞也以同比例混合，用含IL-7(1ng/ml)的10%FBS 1640培养基培养，96孔板每孔1×105细胞，每3天半量换液一次，分别在第5天、10天、15天、20天、25天、30天时，用流式细胞仪检测CD4+T细胞表面分子CD44,CD62L的表达情况；同时在第30天收集细胞标记CFSE后，用OV A-DC或FBS-D再刺激，按照 DC：T=1：10的比例将细胞悬液铺在96孔板中，72小时后用流式细胞仪检测增殖情况；同时用CFSE标记新鲜分离的OT-II和C57BL/6小鼠脾脏CD4+T细胞，同样OV A-DC或FBS -DC刺激，48小时后用流式细胞仪检测增殖情况作为对照。结果：初始CD4+T细胞多为CD44lo CD62L hi，随着培养时间的延长，CD44的表达逐渐升高，CD62L表达降低；OV A-DC刺激OT-II小鼠CD4+T细胞组高达80%以上，在FBS-DC刺激C57BL/6小鼠CD4+T细胞组最后CD44hi CD62L lo细胞比例在70%左右。两组CD4+Tm表达CD44和C
D62L的模式相似；增殖实验示培养了30天的抗原特异性细胞在再次接触同种抗原时反应快速，细胞分裂大部分聚集在第三代、四代、五代。提示此种方法诱导生成的细胞在表型和功能上都具备CD4+Tm的特征。结论：在体外，IL-7可以诱导CD4+Tm生成。用FBS刺激诱导C57BL/6小鼠CD4+Tm生成的状况与用OV A 刺激诱导OT-II 小鼠CD4+Tm生成的状况相似，说明可以用野生型C57BL/6小鼠CD4+T细胞代替OT-II小鼠CD4+T细胞进行CD4+Tm生成机理的研究，所以我们的后续实验均用FBS作为抗原研究诱导CD4+Tm生成的条件和机理。
- 2 -
体外建立CD4+记忆性T细胞生成模型和分子机制的初探 第二部分  不同细胞因子对体外诱导CD4+Tm生成的影响
目的：我们选用细胞因子IL-2,IL-4,IL-7,IL-15,IFN-γ,Flt-3L,TGF-β在体外诱导初始CD4+T细胞，观察T细胞表型CD44和CD62L的表达情况和再次抗原刺激的增殖情况，探讨各种相关细胞因子分别与CD4+Tm产生的关系。方法：无菌条件下取C57 BL/6小鼠的股骨和胫骨, 提取骨髓细胞在体外用FBS刺激，加入IL-4 (1ng/ml)和GM- CSF(10ng/ml)诱导骨髓来源的成熟FBS-DC。无菌条件下取C57BL/6小鼠脾脏，分离单个核细胞，磁珠分选CD4+T细胞；将C57BL/6小鼠的BMDC与CD4+T细胞1:10混合，分别在含IL-2(50U/ml),IL-7(1ng/ml),IL-15(5ng/ml),IL-4 (10ng/ml),IFN-γ (10 ng/ ml),Flt-3L(5ng/ml),
TGF-β(1ng/ml),IL-7+IL-2和IL-7+IL-15 10%FBS1640培养基中培养，96孔板每孔1×105细胞，每3天半量换液一次，分别在第5天、10天、15天、20天、25天、30天时，用流式细胞仪检测CD4+T细胞表面分子CD44,CD62L的表达情况；同时在第30天时分别收集存活下来的细胞标记CFSE后，用FBS-DC再刺激，按照 DC：T=1：10的比例将细胞悬液铺在96孔板中，72小时后用流式细胞仪检测增殖情况。结果：单独用细胞因子IL-4,IL-15,IFN-γ,Flt-3L,TGF-β等培养的体系中，细胞不到20天全部死亡，而细胞因子IL-2,IL-7,IL-7+IL-2和IL-7+IL-15培养体系细胞存活下来；随着培养时间的延长，CD44的表达逐渐升高，CD62L表达降低；另外细胞因子IL-2和IL-7+IL-2培养体系组其CD44hi CD62L lo细胞的产生时间在10天左右，而且所占比例远远高于其他组；增殖实验结果显示，与其他组相比，IL-2
和IL-7+IL-2组的细胞增殖能力显著减弱，其相互之间无明显差别；IL-7+IL-15组与单独IL-7组无明显差别。提示IL-2只能有效地活化CD4+ T细胞，其诱导生成与CD4+ Tm表型相符的细胞，但不具备再次免疫应答时快速增殖的性能；同时在和IL-7共培养体系中，有抑制IL-7的功能，导致不能有效诱导CD4+Tm生成。结论： IL-4,IL-15, IFN-γ,Flt-3L,TGF-β等细胞因子单独在体外不能诱CD4+Tm的生成，同时在IL-7+IL-15培养组与单独IL-7培养组无差别；IL-2不能诱导生成CD4+ Tm，并且抑制了IL-7诱导生成CD4+Tm的功能。查阅文献，未见关于IL-2能抑制IL-7诱导CD4+Tm生成的报道。由于IL-15同样使用IL-2R和γc作为受体的一部分，且IL-15并不抑制IL-7诱导的CD4+Tm生成，说明IL-2的抑制作用可能不是由于通过竞争γc，而与其他信号途径的调节有关。
第三部分  CD4+Tm体外生成的分子机制初探
目的：检测细胞因子IL-7在体外诱导生成CD4+Tm细胞有关信号分子和凋亡蛋白的表达情况，初步探讨IL-7诱导生成CD4+Tm的机制。方法：无菌条件下取C57BL/6小鼠的股骨和胫骨, 提取骨髓细胞在体外用FBS刺激，加入IL-4(1ng/ml)和
- 3 -
第二军医大学硕士学位论文
GM-CSF(10ng/ml)诱导骨髓来源的成熟FBS-DC；无菌条件下取C57BL/6小鼠脾脏，分离单个核细胞，磁珠分选CD4+T细胞；将C57BL/6小鼠的BMDC与CD4+T细胞1:10混合，用分别含IL-7(1ng/ml),IL-2(50U/ml),IL-7+IL-2的10%FBS1640培养基培养，96孔板每孔1×105细胞，每3天半量换液一次，采用实时荧光定量RT-PCR分别在第5d,10d,15d,20d,25d,30d检测细胞因子IL-4,IFN-γ,Bcl-2和Bax mRNA表达水平；另外在培养的第30d用Western-blotting检测STAT5/p-STAT5(Y694),AKT/p-AK T,pro-Caspase-3/ActiveCaspase-3, Bcl-2等分子的蛋白表达水平；同时用刚分离出来的初始CD4+T细胞做相同的检测。结果：与初始CD4+T细胞组相比，IL-7培养体系的IL-4,IFN-γ,Bcl-2的mRNA表达水平都显著增高，同时Bcl-2,p-STAT5的蛋白水平增高，Bax，Active Caspase-3的表达降低。提示IL-7可能通过JAK/STAT信号途径作用于抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白。结论： IL-7通过JAK/STAT5信号function怎么记忆
途径作用于活化的初始CD4+T细胞，上调抗凋亡蛋白Bcl-2和下调促凋亡蛋白，抑制Caspase-3的活化，从而维持已生成的CD4+Tm存活。IL-2抑制IL-7诱导CD4+Tm生成的作用可能与其活化AKT有关。
关键词：CD4+记忆性T细胞，胎牛血清诱导的树突状细胞，白介素7，白介素2
- 4 -

版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。