自噬相关分子Beclin1和LC3在糖尿病肾脏疾病患者血清中的表达及意义
彭娜;胡泽昆;胡大军
【摘 要】目的 探究自噬相关分子Beclin1、LC3在2型糖尿病肾脏疾病(DKD)患者血清中的表达水平及意义.方法 纳入2016年1月至2017年6月期间于宜昌市第二人民医院就诊的2型DKD患者123例,按照尿白蛋白/肌酐比值(ACR)进行分组,分为尿白蛋白正常组(ACR＜30 mg/g)、微量白蛋白尿组(30 mg/g＜ ACR＜ 300 mg/g)、大量白蛋白尿组(ACR＞300 mg/g).同时纳入48例体检健康者作为对照组.收集4组研究对象的一般资料,并且采集静脉血,检测ACR、尿微量白蛋白(UAlb)、Beclin1、LC3的水平.对各指标进行组间差异比较和相关性分析.结果 对照组与尿白蛋白正常组的ACR比较,无统计学差异(P＞0.05);微量白蛋白尿组、大量白蛋白尿组ACR与尿白蛋白正常组比较显著升高,有统计学差异(P＜0.05).4组间的UAlb比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).在Beclin1和LC3水平方面,4组间两两比较显示,差异均具有显著性(P＜0.05),其中对照组最高,大量白蛋白尿组最低.在相关性分析方面,不同组别的DKD患者血清中Beclin1与ACR、UAlb均呈反比,LC3与ACR、UAlb均呈反比.结论 在DKD的发病过程中存在细胞自噬反应,自噬反应的增强可能会对DKD蛋白尿起到一定的抑制作用.
【期刊名称】《临床肾脏病杂志》
【年(卷),期】2018(018)007
【总页数】4页(P417-420)
【关键词】自噬;Beclin1;LC3;糖尿病肾脏疾病
【作 者】彭娜;胡泽昆;胡大军
【作者单位】443000 宜昌,三峡大学第二人民医院肾内科;430018 武汉,武汉市普仁医院重症医学科;443000 宜昌,三峡大学第二人民医院肾内科
【正文语种】中 文
糖尿病肾脏疾病(DKD)是一种极其常见的糖尿病并发症，是由微血管病变引起的，常常与其他脏器的微血管病变等同时发生。随着糖尿病发病人数的不断增加，DKD的患者人数逐渐增多。目前，在终末期肾脏病中，DKD已成为高发疾病，其发病率仅次于肾小球肾炎[1]。DKD患者体内存在着相对复杂的代谢调节机制，使得该病的难度较大，因此早期
发现甚至预防显得更加重要。细胞自噬反应对于维持细胞的内环境稳态、细胞的完整性方面具有重要作用[2]。既往研究结果显示，自噬在肾脏疾病的发生过程中对于肾脏可起到保护作用，能够维护肾脏组织细胞的稳态[3]。DKD的发生过程涉及到内质网应激、活性氧激活等机制[4-5]，而这些机制的发生均与细胞自噬反应相关，故有学者推测细胞自噬在DKD疾病的发生过程中起到重要的作用。动物研究也证实了自噬反应在多种动物肾脏疾病模型中均发挥重要的作用[6]。本研究拟通过对自噬反应过程中的关键分子Beclin1、LC3进行检测和分析，研究两种自噬分子在DKD患者体内的表达水平，并且探讨两者的临床意义，以期为DKD患者的评估及提供一定的参考和依据。
资料与方法
一、研究对象
收集2016年1月至2017年6月期间于三峡大学第二人民医院肾内科就诊的2型DKD患者123例作为研究对象，其中男65例，女58例，年龄43～63岁，平均年龄(53.6±8.2)岁。入选标准：①符合中华医学会糖尿病学分会微血管并发症学组所发布的《糖尿病肾病防治专家共识(2014年版)》[7]中所提出的诊断标准，肾小球滤过率(GFR)低于60 ml·min-1·(1.73 m2)-1
或尿白蛋白/肌酐比值(ACR)高于30 mg/g超过3个月；②系由2型糖尿病所引起的DKD；③同意签署知情同意书。排除标准：①存在肾小球肾炎、肾病综合征等基础肾病者；②存在系统性红斑狼疮、银屑病、过敏性紫癜肾炎等可能会导致肾功异常的自身免疫性疾病者；③近3个月曾使用糖皮质激素或改善肾功能药物者；④存在严重心功能不全、肝功能不全者。本研究为前瞻性研究，全部患者已经签署知情同意书，且获得院伦理委员会的批准。
二、方法
1.分组 全部患者按照ACR进行分组，分为尿白蛋白正常组(ACR<30 mg/g)、微量白蛋白尿组(30 mg/g<ACR<300 mg/g)、大量白蛋白尿组(ACR>300 mg/g)。尿白蛋白正常组44例，男23例，女21例，年龄44～66岁，平均年龄(50.5±6.9)岁；微量白蛋白尿组42例，男22例，女20例，年龄40～67岁，平均年龄(52.2±7.2)岁；大量白蛋白尿组37例，男20例，女17例，年龄41～70岁，平均年龄(54.7±7.3)岁。同时选择48人同期门诊体检健康者作为对照组，其中男24人，女24人，年龄39～72岁，平均年龄(53.1±7.9)岁。4组研究对象在性别、年龄上的差异无统计学意义。
2.标本采集与检测 全部研究对象于检查前一天采取清淡饮食，次日清晨抽取空腹静脉血5
ml，保存至-20 ℃冰箱中待用。患者尿液标准于入院24 h进行检测，检测患者尿微量白蛋白(UAlb)。使用ELISA法检测血清中Beclin1[基尔顿生物科技(上海)有限公司]及LC3(上海艾博抗贸易有限公司)浓度，UAlb使用放射免疫法进行测定，血肌酐使用日本东芝TBA-40FR全自动生化仪进行检测。
三、统计学处理
使用SPSS 19.0软件进行统计学分析，计量资料使用均数±标准差表示。对数据进行方差齐性检验和正态性检验，若方差齐且符合正态性分布，则三组及以上资料之间的差异使用方差分析进行比较，组间两两比较使用LSD-t检验；若不符合正态分布，则使用秩和检验进行比较。相关性分析使用Pearson相关性分析。P<0.05表示差异具有统计学意义。
结  果
一、不同组间ACR、UAlb结果比较
对照组与尿白蛋白正常组的ACR比较，无统计学差异(P>0.05)；微量白蛋白尿组、大量白蛋白尿组ACR与尿白蛋白正常组比较显著升高，有统计学差异(P<0.05)。4组间的UAlb比较，
差异均有统计学意义(P<0.05)。(表1)
modulate
表1 不同组间ACR、UAlb结果比较分组nACR(mg/g)UAlb(mg/L)对照组487.11±1.5710.37±1.59尿白蛋白正常组4413.07±2.9615.42±2.67a微量白蛋白尿组42169.21±56.03ab18.89±3.61ab大量白蛋白尿组37398.22±109.15abc22.36±4.12abc
注：与对照组相比，aP<0.05；与尿白蛋白正常组相比，bP<0.05；与微量白蛋白尿组相比，cP<0.05
二、不同组间Beclin1、LC3结果比较
4组研究对象Beclin1及LC3水平组间两两比较显示，差异均具有显著性(P<0.05)，其中对照组最高，大量白蛋白尿组最低。(表2)
表2 不同组间Beclin1、LC3结果比较分组nBeclin1(ng/ml)LC3(ng/L) 对照组483.07±0.45181.27±52.09尿白蛋白正常组442.41±0.48a134.58±39.57a微量白蛋白尿组422.08±0.40ab101.46±31.02ab大量白蛋白尿组371.51±0.37abc79.17±26.25abc
注：与对照组相比，aP<0.05；与尿白蛋白正常组相比，bP<0.05；与微量白蛋白尿组相比，cP<0.05
三、相关性分析
尿白蛋白正常组的DKD患者血清中Beclin1与ACR、UAlb呈反比，LC3与ACR、UAlb呈反比。微量蛋白尿组的DKD患者血清中Beclin1与ACR、UAlb呈反比，LC3与ACR、UAlb呈反比。大量蛋白尿组的DKD患者血清中Beclin1与ACR、UAlb呈反比，LC3与ACR、UAlb呈反比。(表3)
表3 不同组Beclin1、LC3与ACR、UAlb的相关性分析Beclin1LC3rP值rP值尿白蛋白正常组ACR-0.3180.035-0.3390.024UAlb-0.4010.007-0.3830.010微量白蛋白尿组ACR-0.3110.045-0.3300.033UAlb-0.3420.027-0.3670.017大量白蛋白尿组ACR-0.3990.012-0.3550.027UAlb-0.3480.030-0.3600.024
讨  论
细胞自噬反应主要表现为两方面效应：一方面通过自噬过程及时清除衰老及受到损伤的细
胞、细胞器及其中的蛋白质物质，增强细胞抵抗外界变化的能力；另外一方面，当机体中存在过度自噬激活的情况时，可能会通过溶酶体介导的自噬反应引起细胞大量死亡，而对组织造成一定的损伤。在自噬的发生过程中，涉及到许多重要的自噬调节因子，如mTorc1、Beclin1、LC3等[8-10]。Beclin1蛋白的中央卷曲螺旋区能够与UVRAG相结合，进而调节III型磷脂酰肌醇3-激酶的活性，从而促进自噬体膜的形成。LC3蛋白定位于前自噬体及自噬模体的表面，该蛋白在自噬体的延长及成熟过程中具有重要作用。LC3-I型蛋白水平下降则会影响LC3-II型蛋白的水平[11]。研究发现，诸多疾病的发生过程中存在自噬反应，这些疾病包括肿瘤、阿尔茨海默病、炎症性疾病等[12-13]。目前，国内外已经有一些针对DKD与自噬反应的相关研究，但是尚不明确细胞自噬反应在DKD的发生过程中起到何种作用，是促进疾病的发生，还是抑制疾病的进展。此外，这些已有的研究是针对mTorc1、Sir1等自噬分子进行研究，且主要集中于动物研究；而对人体中自噬反应进行的研究较少，尚未查询到有关Beclin1、LC3的相关研究。本研究对自噬反应过程中的关键性标志物进行ELISA蛋白水平检测，检测Beclin1和LC3两种标志物在不同严重程度DKD患者血清中的表达水平，同时结合DKD患者的ACR、UAlb临床指标进行相关性分析，研究这些指标与Beclin1和LC3表达水平之间的关系，进而探究Beclin1和LC3在DKD发生过程中的意义。
本研究结果显示，4组患者中，Beclin1的表达量以对照组表达最高(3.07±0.45) ng/ml，而大量蛋白尿组的患者表达量最低(1.51±0.37) ng/ml；同样，LC3的表达量以对照组表达最高(181.27±52.09) ng/L，而大量蛋白尿组的患者表达量最低(79.17±26.25) ng/L。这些研究结果说明，在2型DKD患者疾病的发生过程中，存在着细胞自噬反应，随着病情的加重，细胞自噬反应的水平有所降低，自噬反应可能在DKD过程中发挥重要作用。3个不同组别患者的相关性分析的结果也显示，不同严重程度的DKD患者血清中自噬反应关键标志物Beclin1、LC3与ACR、UAlb均呈反比，说明在DKD患者的发病过程中，细胞自噬反应对疾病起到一定的抑制作用，若自噬增强则DKD病情减轻，尿微量蛋白有所减少；若自噬减弱则DKD病情加重，尿微量蛋白则会增加。其相关机制可能是由于DKD的发生涉及到足细胞、系膜细胞及肾小球内皮细胞，当足细胞、系膜细胞等这些滤过屏障的细胞受到损伤时，则会发生一定的自噬反应，但高血糖会对自噬反应产生抑制，使内皮细胞损伤及受损蛋白质的清除降解能力下降，产生的蛋白质由于无法降解而穿过滤过屏障，形成蛋白尿。细胞自噬水平的下降，可能会导致氧化的蛋白与泛素化的蛋白在足细胞中大量沉积，从而导致了足细胞的损伤，最终导致尿蛋白的产生及肾小球硬化[14]。有研究显示，高血糖能够通过影响P62/SQTMI来抑制细胞的自噬反应[15]。还有相关研究显示，通过使用雷帕霉素提高自噬
反应的能力后，肾小球足细胞的损伤程度降低，而足细胞的胰岛素抵抗得到有效减轻，提示自噬反应与足细胞之间存在密切关系，自噬增强能够对蛋白尿的产生起到一定的抑制作用[16]。

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