慢性创面生物膜分散机制的研究进展
谢楚玉
【期刊名称】《重庆医学》
【年(卷),期】2018(047)004
【总页数】4页(P560-563)
【关键词】细菌生物膜;体感应系统;分散机制;促降解酶
【作 者】谢楚玉
【作者单位】重庆医科大学附属第二医院急诊外科 400010
【正文语种】中 文
【中图分类】R641
慢性创面是指在可预测的时间内(一般指1个月)仍不能通过有序的修复阶段达到创面愈合的创面[1]，临床中常见的慢性创面有糖尿病足溃疡、压力性溃疡、下肢静脉溃疡、手术部位伤口感染、脓肿、创伤性溃疡等。BESSA等[2]报道了创面中常见的细菌种类统计情况为金黄葡萄球菌37%，其次是铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)17%，奇异变形杆菌10%，大肠埃希菌6%和棒状杆菌属5%,其中约27.1%的创面中检测为多种混合细菌感染。细菌生物膜(bacterial biofilm，BF)的存在有助于慢性创面的发展，其中约60.0%慢性创面中检测到了BF的存在[3]。BF的发展包括3个阶段：黏附期、成熟期、分散期。分散期是生物膜发展的最后阶段，生物膜中的部分细菌会恢复为浮游状态，向周围环境扩散，逐渐在新的部位形成生物聚集体[4]。本文基于促BF的分散解离作用综述如下。
modulate1 生物膜的分散机制
BF形成是慢性创面难愈合的重要因素，细菌在生长过程中为适应生存环境而吸附于创面表面，由细菌和其分泌的细胞外基质组成。BF形成是一种连续动态发展过程，分散期是BF发展的最后阶段，一旦生物膜中的废物大量堆积和营养物质耗竭时，体感应系统、促降解酶和其他特殊化合物等能调节降解生物膜的细胞外多糖、细胞外蛋白质和eDNA等，这些均
可导致生物膜分散。生物膜分散一方面使细菌由顽固生物膜状态恢复到相对脆弱的浮游状态，并向周围环境扩散，逐渐在新的部位形成生物聚集体，使感染进一步扩散；另一方面细菌处于浮游状态下，有利于增强抗生素、清创等传统手段对创面的有效性[4]。
1.1 BF分散与体感应系统 BF体感应系统(quorum sensing，QS)指细菌通过分泌相关信号分子，感知菌体周围环境的细菌体密度，进而调控相关基因的表达,是细菌调控生命活动的主要机制之一。近年来有研究表明，QS在调节BF的分散阶段中有一定作用[5]。生物膜形成是细菌以协作的方式完成的最常见的过程之一，QS作为细菌协作的重要机制，广泛存在于G-和G+菌中。QS信号分子主要包括酰基高丝氨酸内酯(N-acylhomoserine lactone,AHL)，呋喃酮酰硼酸(furanosyl borate diesters,AI2)，顺式不饱和脂肪酸(DSF家族信号)和肽[6]。以P．aeruginosa为例，其体感应系统是由拥有两个完整的AHL系统(Las Ⅰ/Las R和Rh Ⅰ/Rh Ⅰ R)和喹诺酮类信号分子系统(pseudomonas quinolone signal，PQS)构成，通过调控构建生物膜基质中富含葡萄糖基因pel的转录化合物的合成来促进生物膜的分散；通过调控表面活性剂(鼠李糖脂等)的生成促进生物膜的解离[6]。DIAZ等[7]在研究表面活性剂(鼠李糖脂)对枯草芽孢杆菌BBK006生物膜的破坏或抑制作用过程中，得出鼠李糖脂的产生受QS感应系统调节，有利于BF的分散；此外，QS还可以调控细菌胞内第二信使c-d
i-GMP，c-di-GMP的增加能促进生物膜的形成，反之则抑制生物膜的形成，更利于分散解离[8]。在金黄葡萄球菌BF形成过程中的QS系统是指辅助基因调节系统(accessory gene regulator，Agr)，Agr系统由膜结合蛋白(Agr B)、Agr B修饰的前体肽(Agr D)、组氨酸蛋白激酶(Agr C)及Agr C可识别的反应调节子(Agr A)组成的细菌双组分信号转导系统[6]。Agr系统在金黄葡萄球菌中激活后，能启动其RNAⅢ效应分子的表达，进而调控多种毒力因子的产生，比如调控具有表面活性剂性质的特定类别的分泌肽——酚可溶性调节肽(phenol soluble modulins，PSMs)。PSM不仅可以直接影响生物膜分散，而且可以通过影响生物膜的体积、厚度、粗糙度及通道形成，进一步调节生物膜的分散。总之，在生物膜分散期，细菌可利用QS系统影响种的社会行为，进而调控BF的形成或分散。然而，对于混合菌生物膜间QS系统的相互作用仍需进一步研究。
1.2 BF分散与降解酶
1.2.1 蛋白酶类 细胞外蛋白质是细胞外聚合物(extracellular polymeric substance，EPS)的重要组成成分，外源蛋白质对维持和修饰EPS的能力至关重要。降解细胞外蛋白质是降解EPS的措施之一，可促进生物膜分散发生。金黄葡萄球菌作为创面中常见革兰阳性病原
体，可分泌10余种的蛋白酶，包括7种丝氨酸蛋白酶(SspA和SplA-F等)，2种半胱氨酸蛋白酶(SspB和ScpA)和1种金属蛋白酶(Aur)，其中SspA、SspB、ScpA和Aur均被证明参与生物膜的破坏[9]。LOUGHRAN等[10]将Aur，ScpA和SspB在体外纯化，并通过外源性的方式加入已建立的金黄葡萄球菌生物膜中，分析其结果显示均具有促进生物膜分散的作用，且Aur是效果最明显的。Aur是一种葡萄球菌金属蛋白酶，可通过降解生物膜相关蛋白(biofilm-associated prtein，Bap)和凝集因子B(clumping factor B，ClfB)破坏金黄葡萄球菌生物膜[11]。
1.2.2 脱氧核糖核酸酶类(DNase) 在许多生物膜中，细胞外DNA(eDNA)作为EPS的结构性支架，可促进细菌黏附、聚集。在2002年，WHITCHURCH等[12]发现eDNA是BF的另一重要组成部分，经体外试验加入外源性脱氧核糖核酸酶(DNase Ⅰ)能够抑制P．aeruginosa生物膜的形成，用DNase Ⅰ处理已建立的P．aeruginosa生物膜60 h后，分析其结果显示DNase Ⅰ可促进生物膜分散。用DNase Ⅰ预处理金黄葡萄球菌生物膜后，再加用妥布霉素后可增强妥布霉素的杀菌活性，这可能与DNase Ⅰ能降解eDNA有关[13]。有研究发现，DNase 1L2也能促进P．aeruginosa及金黄葡萄球菌的生物膜分散[14]。链球菌去氧核糖核酸酶也能干扰已建立的P．aeruginosa生物膜[15]。
1.2.3 糖苷水解酶类 糖苷水解酶类主要是水解生物膜中的细胞外多糖成分。细胞外多糖为生物膜的建立和维持提供了许多重要帮助，比如结构稳定性、耐药性、对宿主免疫进行物理和化学防御、促微生物细胞的黏附和聚集及在营养不足时提供碳源。经研究，至少有3种细胞外多糖参与P．aeruginosa感染的生物膜形成，如，Psl、Pel和藻酸盐，藻酸裂解酶能降解P．aeruginosa菌株生物膜细胞外多糖-藻酸盐导致生物膜分散； PslG具有糖苷内切酶的典型特征,主要破坏Psl基质以分散生物膜中的细菌[16]。分散蛋白 B( Dsp B)通过水解β-(1,6)糖苷键来降解多糖，能破坏β-1，6-乙酰氨基葡聚糖(poly-β-1,6-N-acetyl-d-glucosamine,PNAG)，破坏其生物膜基质，促进生物膜分散解离，使细菌成浮游状态[17]；该酶能作用于多种BF，包括金黄葡萄球菌，放线菌素，表皮葡萄球菌，鲍曼不动杆菌，肺炎克雷伯杆菌，大肠埃希菌，伯克霍尔德菌属和荧光假单胞菌。研究发现，多种细菌能产生透明质酸酶，透明质酸酶促进生物膜的分散主要是通过分解透明质酸；而当透明质酸酶缺陷时能抑制生物膜的分散[18]。纤维素酶可由多种微生物产生，其水解的部位是β(1,4)糖苷键。FLEMING等[19]研究发现，α-淀粉酶、纤维素酶能导致金黄葡萄球菌和P．aeruginosa生物膜的分散。
1.3  BF分散与特殊化合物的产生 此外，生物膜分散与一些特殊化合物的产生相关。生物表
面活性剂主要是微生物细胞表面的两亲化合物，它所具有的表面活性作用能降低细胞与细胞间、细胞与基质间的黏附作用[20]，此前有报道将生物表面活性剂作为金黄葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和肺炎克雷伯杆菌的抗菌剂。鼠李糖脂是一种糖脂生物表面活性剂，由连接到脂肪酸链上的二-鼠李糖或单-鼠李糖构成，经试验发现能促进生物膜分离[7]。PSM-β肽能促进表皮葡萄球菌生物膜结构分离[21]。XING等[22]研究发现，D-氨基酸(D-amino acids)可以预防生物膜的形成并分解枯草芽孢杆菌、P．aeruginosa和金黄葡萄球菌的现有生物膜；D-氨基酸可以由多种细菌产生，通过调整外源性D-酪氨酸水平，生物膜环境中D-酪氨酸水平越高，黏附性越低，破坏率越高，推测D-酪氨酸可能是生物膜分散的一种信号之一。此外，温度、pH 值和营养条件(如营养饥饿)[23]、一氧化氮(nitric oxide,NO)[24]、金属敖合剂[25]、脂肪酸样信号[26]、乳铁蛋白[27]等多种因素均可调节生物膜的分散。
2 生物膜分散的临床意义
慢性创面生物膜为微生物体的生存创造了更好的条件，不利于慢性创面愈合。慢性创面的传统手段一般为采用大剂量的抗生素、物理清创、负压吸引及新型敷料等，但其效
果均有一定的局限性，且经后，这些慢性伤口常复发。生物膜通过黏附素黏附于宿主或物体的表面，其细胞外基质有助于生物膜抗生素耐药性的形成。通过促进生物膜分散阶段的发生，联合传统方案可能更利于创面愈合。研究表明QS参与生物膜形成、维持和分散，QS抑制剂(QS inhibition，QSI)可以抑制QS信号分子合成或降解；抑制信号分子与受体的结合或抑制信号转导级联的触发来实现QS抑制。BRACKMAN等[5]提出QSI可作为抗菌剂，如S-腺苷同型半胱氨酸、西奈芬近、5-甲基硫代腺等。金缕梅能干扰金黄葡萄球菌TraP QS系统，通过对细菌细胞壁厚度的影响和生物膜eDNA降解释放，来达到生物膜易感性。从分子层面上来看可能是通过肽聚糖和肽聚糖前体的生物合成(包括参与L-赖氨酸和葡糖胺-6-磷酸合成的基因)和自溶调节剂(如lytS)的差异性表达，最终实现对金黄葡萄球菌生物膜的干预。KUTTY等[28]研究制备不同NO供体的AHL-NO杂交体作用于P.aeruginosa生物膜，并评估其生物学作用，结果表明以硝酸盐为供体NO的AHL杂交体其生物活性最高，能抑制QS并减少相关的毒力因子合成，这可能提示将不同的化合物混合可能表现出协同效应。BHATTACHARJEE等[29]研究发现由P.aeruginosa产生的鼠李糖脂同样对大肠埃希菌生物膜起分散作用，这可能与鼠李糖脂选择性地改变了大肠埃希菌膜对某些分子的渗透性(如亲脂性AHL中的3oxoC12HSL)有关。然而单独应用鼠李糖脂对大肠杆菌
缺乏任何生长抑制或生物膜分散活性，这提示细菌衍生的分散剂不但可以分散自身生物膜，还可以对一些其他细菌物种生物膜起分散作用。这种能诱导自分散和种间分散的信号分子为以混合菌感染为主的慢性创面提供新的方向。体外实验证明乙二胺四乙酸(EDTA)是P．aeruginosa和金黄葡萄球菌生物膜的有效分散剂和杀菌剂，加用EDTA可致QS中AI2水平降低，这也为开发抵抗细菌感染的无毒的、有效的AHL拮抗剂提供基础。EDTA 和庆大霉素联用对P．aeruginosa生物膜的清除能力优于单独应用EDTA，考虑二者存在协同作用关系[30]。经生物膜降解酶DNase Ⅰ及分散蛋白B预处理的金黄葡萄球菌生物膜可增强妥布霉素的杀菌活性[13]。

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