山西农业科学 2023，51（9）：1034-1041Journal of Shanxi Agricultural Sciences
葡萄VvWRKY70基因生物信息学及表达特性分析
李晋圆1，李莉娟1，宋晶晶1，闫冬梅1，董志刚2，仪慧兰1
（1.山西大学生命科学学院，山西太原030006；2.山西农业大学果树研究所，山西太谷 030800）
摘要：WRKY是植物特有的转录因子，在多种生物和非生物胁迫中发挥作用。基于RNA-seq技术，课题组前
期研究发现，SO2熏蒸结合低温保鲜过程中多个功能未知的葡萄WRKY基因差异表达。经氨基酸序列同源性比
对，研究选择与AtWRKY70氨基酸序列相似度最高的VvWRKY70进行生物信息学及表达特性分析。生物信
息学分析结果表明，VvWRKY70基因启动子区含有W-box元件及茉莉酸甲酯、水杨酸等激素响应元件；编码蛋
白由322个氨基酸组成，分子质量约36.57 ku，属亲水性蛋白；该蛋白丝/苏氨酸含量丰富；二级结构主要由无规
卷曲和α-螺旋组成，N端含有高度保守的WRKY结构域，C端为C2HC型锌指结构，属WRKY第Ⅲ亚家族；预测
显示，其主要定位于细胞核中，且在进化上较为保守。qRT-PCR分析表明，VvWRKY70在玫瑰香葡萄根、茎、叶、花蕾、果中均有表达；葡萄果实VvWRKY70受SO2和灰霉菌诱导上调表达，低温处理组下调表达。综上可
见，VvWRKY70可能作为转录因子参与调节植株生理和果实发育过程，并在葡萄果实采后SO2保鲜过程中发挥
作用，调节果实贮藏期间的生物和非生物胁迫应答。
关键词：葡萄；VvWRKY70；生物信息学；转录特征
中图分类号：S663.1 文献标识码：A 文章编号：1002‒2481（2023）09‒1034‒08
Bioinformatics and Expression Characteristics Analysis of
VvWRKY70 Gene in Vitis vinifera L.
LI Jinyuan1，LI Lijuan1，SONG Jingjing1，YAN Dongmei1，DONG Zhigang2，YI Huilan1
（1.School of Life Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；
2.Institute of Pomology，Shanxi Agricultural University，Taigu 030800，China）
Abstract：WRKY transcription factors(TFs), as plant-specific transcription factors, play significant roles in various biological and abiotic stress. In this study, based on RNA-seq analyses, many differentially expressed grapes WRKY genes with unknown function were found during the process of SO2 fumigation combined with low temperature preservation. Through amino acid sequence homology comparison, VvWRKY70 which had the highest similarity to the amino acid sequence of AtWRKY70 was selected for bioinformatics and expression characteristics analysis. The results of bioinformatics analysis showed that the promoter region of VvWRKY70gene contained W-box element and the response elements to the hormones such as methyl jasmonate and salicylic acid. VvWRKY70encoding protein was composed of 322 amino acids with a molecular weight about 36.57 ku and hydrophilic, rich in serine/threonine. The secondary structure was mainly composed of random coil and α-helix. The N-terminal contained a highly conserved WRKY domain, and the C-ter
minal was a C2HC zinc finger structure, belonging to the third WRKY subfamily. Predictions also showed that VvWRKY70 protein was mainly located in the nucleus and conserved in evolution. Analysis of qRT-PCR showed that the VvWRKY70expressed in Muscat root, stem, leaf, bud, and fruit. The expression of VvWRKY70in fruit was up-regulated by SO2and Botrytis cinerea, and down-regulated by low temperature. These results revealed that VvWRKY70 was probably involved in regulation of the process of plant physiology and fruit development, played a role in the process of SO2preservation of fruits after harvest, and regulated the biotic and abiotic stress responses during fruit storage.
Key words：Vitis vinifera L.; VvWRKY70; bioinformatics analysis; transcriptional characteristics
WRKY基因组成了植物特有的转录因子家族，编码蛋白具有高度保守的WRKYGQK氨基酸序列，参与植物生长发育、物质代谢及非生物（紫外线、低温、H2O2等）和生物（病原菌）胁迫应答[1-2]，是
doi
doi:10.3969/j.issn.1002-2481.2023.09.08
收稿日期：2023-01-03
基金项目：国家自然科学基金项目（3197161278；31371868）
作者简介：李晋圆（1995-），女，山西保德人，在读博士，研究方向：果蔬保鲜分子机制。
通信作者：仪慧兰（1963-），女，山西新绛人，教授，博士，主要从事果蔬保鲜分子机制研究工作。
李晋圆等：葡萄VvWRKY70基因生物信息学及表达特性分析
植物天然免疫系统的核心成员。近年来，随着植物基因组测序结果的公布，很多物种的WRKY转录因子家族被预测和鉴定，不同物种中WRKY家族拥有的成员数量差异较大，如拟南芥（Arabidopsis thaliana）中有74个[3]，苹果（Malus sieversii）中有127个[4]，水稻（Oryza sativa）中有102个[5]等。根据N端WRKY结构域数目和C端锌指结构的特征，WRKY转录因子被分为3类，第Ⅰ类通常含有2个WRKY结构域和C2H2型锌指结构，第Ⅱ类和第Ⅲ类含有1个WRKY结构域，C端锌指结构第Ⅱ类为C2H2型，第Ⅲ类为C2HC型[6]。WRKY蛋白可通过特异性结合启动子区Wbox（TTGACT/C）顺式作用元件而激活或抑制下游靶基因的表达[7]，也可与其他蛋白形成复合体，使转录因子与DNA的结合活性增强或抑制[8]。此外，WRKY转录因子还可受激酶调控，参与植物对病原菌的响应[8]。
值得注意的是，部分WRKY转录因子已被证明在果实软化和生物胁迫中发挥重要作用。研究表明，野生草莓FvWRKY48可增加果胶裂解酶基因FvPLA的表达，促进细胞壁中果胶质的裂解，加速果实软化[
9]；FaWRKY25通过负调控茉莉酸信号转导通路，调节草莓果实对灰霉菌的抗性[10]。拟南芥AtWRKY70参与水杨酸（SA）和茉莉酸防御信号途径[11]，调控抗病基因（R）介导的抗性、系统防御应答和诱导系统抗性等过程[12-13]；番茄SlWRKY70能激活抗病基因Mi-1的表达，增强对线虫和蚜虫的抗性[14]，小麦TaWRKY70可激活水杨酸信号转导通路，调节植株对条锈菌的抗性[15]。
葡萄作为全球广泛种植的果树作物，具有重要的经济价值，但鲜食葡萄保鲜机制尚不清楚，影响和限制了葡萄的保鲜处理。依据WRKY家族的分子特征，在葡萄基因组中共预测到59个WRKY家族成员[16]，但仅有17个VvWRKYs功能被研究[17-20]，其中VvWRKY1、VvWRKY2、VvWRKY33和VvWRKY52等6个WRKYs转录因子通过同源或异源过表达的方式被证实在植株应对生物胁迫过程中发挥调控作用[17,19,21-22]。
课题组前期在SO2保鲜60 d的玫瑰香葡萄果实转录组中发现了差异表达的17个葡萄WRKYs （VvWRKYs）基因，基于AtWRKY70在植物免疫应答中的调控作用[11-13]，将其中编码蛋白与AtWRKY70序列同源性相似度最高的一个基因暂命名为VvWRKY70。本研究运用生物信息学技术对VvWRKY70启动子及其编码蛋白质的性能
进行预测，并对其转录特征进行分析，旨在为深入研究VvWRKY70的生物学功能及其在鲜食葡萄保鲜中的作用提供依据。
1 材料和方法
1.1 试验材料
葡萄材料取自山西农业大学果树研究所（山西，太谷）。选商用成熟玫瑰香（Vitis vinifera L. cv. Muscat）葡萄果穗，采用二氧化硫（SO2）结合低温（0 ℃）的方式保鲜，对照组处于相同条件只是不加SO2保鲜剂[23]。取SO2保鲜60 d果实和同期对照组果实进行转录组测序，出差异表达的VvWRKY 基因，将编码蛋白与拟南芥AtWRKY70氨基酸序列同源性最高的1个基因暂命名为VvWRKY70，该基因登录号为LOC100255013，编码蛋白质序列登录号为XP_002272504.1。
取玫瑰香葡萄藤条上的根、茎、幼叶、成熟叶、花蕾、幼果及成熟果实的果皮和果肉，用于RNA提取。选泽接近的成熟果穗分组，分别进行SO2保鲜处理[23]，低温（0 ℃）和灰霉菌孢子（5.0×106 cfu/mL）喷施处理。处理一定时间后，随机选取果粒，用纯净水冲洗，剥取果皮液氮速冻后于-80 ℃保存备用。
1.2 试验方法
1.2.1 生物信息学分析方法 使用PlantCARE （bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plant⁃care/html/）分析基因VvWRKY70启动子区顺式作
用元件；在线工具ProtParam（pasy. org/protparam/）分析VvWRKY70蛋白的理化性质；用ProtScale（/protscale/）分析VvWRKY70氨基酸序列的疏水性/亲水性，NetPhos3.1（www.cbs.dtu.dk/services/Net⁃Phos/）预测VvWRKY70蛋白磷酸化位点，SOPMA （npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page=/NPSA/npsa_sopma.html）预测VvWRKY70二级结构，Conserved Domains（bi. v/Structure /i）预测VvWRKY70保守结构域，SWISS-MODEL预测VvWRKY70三级结构，WoLFPSORT（wolf⁃psort.hgc.jp/）预测VvWRKY70亚细胞定位。Bioedit软件分析VvWRKY70及其同源蛋白氨基酸序列特征，软件MEGA7.0的N-J法构建VvWRKY70进化树（bootstrapped=1 000），用到的GenBank登录号如下：拟南芥AtWRKY70（NP_ 191199.1）、大麦HvRGA5-like（XP_044984274.1）、
山西农业科学 2023 年第 51 卷第 9 期
水稻OsWRKY70（XP_015638920.1）、小麦TaWR-KY70（XP_044377883.1）、玉米Zm-unknown（ACF 82210.1）、高粱SbWRKY54（XP_002460069.1）、二穗短柄草BdWRKY70（XP_010228655.1）、大豆GmWRKY70（XP_006599732.1）、番茄SlWRKY80（NP_001352740.1）、苜蓿MtWRKY70（XP_003623 634.1）、毛果杨PtWRKY70（XP_002309186.3）、蓖麻RcWRKY70（XP_002528697.1）、莱茵哈德衣藻CrCHLRE（XP_0429
25408.1）、翠柏氏藻TrWRKY （KAA6429813.1）、小立碗藓PpWRKY33（XP_ 024358453.1）。
1.2.2 基于qRT-PCR的VvWRKY70表达分析葡萄RNA提取采用改良CTAB法[24]，使用Prime⁃Script RT reagent Kit with gDNA Eraser合成cDNA 第1链，之后用SYBR Premix Ex TaqTMII PCR Kit进行qRT-PCR检测，引物序列如表1所示。每个反应设3个重复，以Vvactin7为内参基因，采用2-ΔΔCt 计算VvWRKY70的相对表达量。
1.3 数据分析
使用SPSS对检测结果进行方差分析；采用Duncan法分析多组样本间的差异显著性，t检验分析处理组与对照组之间的差异。
2 结果与分析
2.1 VvWRKY70基因启动子区的顺式作用元件
提取VvWRKY70 CDS上游2 000 bp序列进行顺式作用元件分析，发现VvWRKY70基因启动子区除含有W-box元件外，还含有水杨酸（SA）、茉莉酸甲酯（MeJA）和脱落酸（ABA）等与植物防御相关的响应元件，以及响应干旱的MYB结合位点（MBS）（图1），说明VvWRKY70转录因子可能在植物防御应答网络中发挥作用，参与植株对生物和非生物胁迫的应答。
2.2 VvWRKY70蛋白的理化性质
2.2.1 葡萄VvWRKY70蛋白的基本性质 用Ex⁃PASyProtParam对葡萄VvWRKY70蛋白的理化
性质进行分析，结果显示（图2），VvWRKY70共有322个氨基酸，丝氨酸（Ser）含量最丰富，占总量的14.0%，其次是天冬氨酸（Asp）、亮氨酸（Leu）和苏氨酸（Thr），分别占7.8%、7.1%和6.8%；半胱氨酸（Cys）、脯氨酸（Pro）和氨酸（Trp）含量较少，分别占2.5%、2.2%和1.2%；带正电荷的氨基酸（His+ Arg+Lys）总数为47，带负电荷的氨基酸（Asp+ Glu）总数为47。其理论分子质量约为36.57 ku，理论等电点为5.49。不稳定系数为66.07（>40.00），推测为不稳定蛋白。
2.2.2 葡萄VvWRKY70氨基酸序列的疏/亲水性预测 了解蛋白质的疏水性/亲水性对其高级结构的形成和功能预测具有参考价值。利用软件ProtScal，根据Kyte & Doolittle算法[25]预测（滑窗= 9），在VvWRKY70蛋白中亲水氨基酸在整个蛋白分子中都有分布，约占氨基酸总量的79.9%，明显多于疏水氨基酸（图3），推测VvWRKY70为亲水性蛋白。同时使用ProtParam工具预测到该蛋白平
表1 qRT-PCR所用引物序列Tab.1 Primers for qRT-PCR
基因名称 Gene name VvWRKY70
Vvactin7引物序列F（5′—3′） Primer sequence F(5′-3′) CCATACCAATAACAACAACAAGAACAAC
CTTGCATCCCTCAGCACCTT
引物序列R（5′—3′） Primer sequence R(5′-3′)
AAACCGATAAGAACATCATCAAAGTCC
TCCTGTGGACAATGGATGGA
图1 VvWRKY70基因启动子区顺式作用元件
Fig.1 Cis-acting elements in the promoter
region of
VvWRKY70
图2 VvWRKY70的氨基酸组成分布
Fig.2 Amino acid composition distribution of
VvWRKY70
李晋圆等：葡萄VvWRKY70基因生物信息学及表达特性分析
均亲水指数为-0.907，属于亲水蛋白，预测结果与ProtScal 一致。VvWRKY70具有一定数量的疏水氨基酸，这有利于其通过疏水作用形成疏水核心，被亲水组分包围，形成一定的空间构象。
2.3 葡萄VvWRKY70蛋白磷酸化位点预测
细胞内蛋白质磷酸化在信号转导中发挥着重要作用。利用在线工具NetPhos3.1（得分大于0.5为可能的磷酸化位点）分析，结果发现（图4），
VvWRKY70可能存在多个丝氨酸（Ser ）、苏氨酸（Thr ）和酪氨酸（Tyr ）磷酸化位点，其中Ser 、Thr 和Tyr 磷酸化位点分别有34、10、4个，由此推测，VvWRKY70的激活可能与蛋白质磷酸化有关，受细胞激酶信号的调节。
2.4 葡萄VvWRKY70的二级结构预测
用SPOMA 预测结果发现（图5），葡萄VvWRKY70二级结构包含无规卷曲、α-螺旋、β-折叠片层和β-转角4种结构，分别占蛋白分子的62.73%、22.98%、10.87%和3.42%，其中，无规卷曲是VvWRKY70的主要二级结构，α-螺旋和β-折叠片层结构散在分布于整个肽链中。
2.5 葡萄VvWRKY70的结构域和亚细胞定位预测
对葡萄VvWRKY70进行保守结构域分析，发现其第135—195位氨基酸是典型的WRKY 保守结
构域（图6-A ）。SWISS -MODEL 软件预测其三级结构发现，第135—195位氨基酸可形成特定的高级结构（图6-B ）
。
图3 VvWRKY70的疏水性/亲水性预测结果Fig.3 Hydrophobic and hydrophilic
prediction of VvWRKY70
图4 预测的VvWRKY70磷酸化位点
Fig.4
Predicted phosphorylation sites of VvWRKY70
横轴表示氨基酸位置；蓝表示α-螺旋；红表示β-折叠延伸链；绿表示β-转角；紫表示无规卷曲
bootstrappedThe horizontal axis represented the amino acid position; Blue. α-helix; Red. β-sheet extension chain; Green. β-turn; Purple. Random coil
图5 预测的VvWRKY70二级结构
Fig.5
Predicted secondary structure of VvWRKY70
图6 VvWRKY70的保守结构域及其高级结构
Fig.6 VvWRKY70 protein conservative domain and its advanced structure
山西农业科学 2023 年第 51 卷第 9 期
WoLF PSORT 预测显示，VvWRKY70定位于细胞核中的预测值为13，在细胞质中的预测值为1，初步推测VvWRKY70可能位于细胞核中，这与转录因子发挥功能的场所吻合。
2.6 VvWRKY70的系统进化树分析与功能预测
BlastP 工具检索到与VvWRKY70序列同源性较高的16种植物（分别属于苔藓、地衣、蕨类、单子叶植
物和双子叶植物）的WRKY 家族成员；利用BioEdit 软件分析比较氨基酸序列，发现VvWRKY70蛋白的氨基酸序列N 端含有一个保守的WRKYGQK 序列，C 端含有C 2HC 型锌指结构
（图7-A ），属于WRKY 第Ⅲ亚家族。使用MEGA 7.0软件构建VvWRKY70系统发育树，发现系统发育树中双子叶和单子叶植物分别聚成一支，而低等植物分支较远，属于远源物种，这与植物物种进化过程一致，说明VvWRKY70在进化上趋于保守（图7-B ），在植物中可能发挥着基础的生物学功能。通过类比其他物种同源性相近的WRKY 转录因子功能（表2），预测VvWRKY70可能在植物响应非生物胁迫和病原真菌侵染中发挥重要的生物学功能。
2.7 VvWRKY70组织表达模式及在葡萄果实中的诱导表达分析
RT -PCR 发现，VvWRKY70在玫瑰香葡萄的根、茎、幼叶、成熟叶、花蕾、幼果及成熟果实的果皮和果肉中均有表达（图8-A ），成熟叶中表达量最高。选取与葡萄保鲜过程密切相关的3个环境因子低温、灰霉菌和SO 2保鲜处理葡萄果实，结果发现，低温处理后，相比于同期对照组，VvWRKY70显著下调表达（图8-B ）；而SO 2保鲜和灰霉菌处理组相比于同期对照组葡萄果皮中VvWRKY70上调表达（图8-C 、D ）
。说明在采后保鲜过程中葡萄
A.VvWRKY70氨基酸多序列比对；
B.VvWRKY70蛋白系统进化树
A. Multiple sequence alignment of VvWRKY70 amino acid;
B. The phylogenetic relationship of VvWRKY70 protein
图7 VvWRKY70氨基酸序列分析及系统发育树
Fig.7 Analysis of amino acid sequence and phylogenetic tree of VvWRKY70
表2 不同物种中与VvWRKY70相似性较高的蛋白质的功能描述
Tab.2 Functional description of proteins with high similarity to VvWRKY70 in different species
序号 Number
12345678
名称 Name VpWRKY1AtWRKY70FcWRKY70SlWRKY70PsnWRKY70TaWRKY70MfWRKT70PlWRKY70
登录号 Login number
ACY69975.1NP_191199.1AKA59519.1SGN -U582610016G137900XP_044444723.1
UIE54554AMW90776.1
物种 Species Vitis pseudoreticulata Arabidopsis thaliana Fortunellacrassifolia Solanum lycopersicum Populus simonii×Populus nigra
Triticum aestivum Myrothamnus flabellifolia
Paeonia lactiflora
功能 Function
抗白粉病，抗盐胁迫[2]
抗病原真菌，调节植物免疫；SA/JA 调控中枢[11-12]；正调控干旱胁迫[26]正向调控干旱胁迫应答[27]抗蚜虫和线虫[14]
负调控盐胁迫和枯叶病[28]抗条锈病[15]
抗旱、抗盐胁迫[29]
抗低温、盐和涝渍胁迫[30]
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