第四届全国肝脏疾病学术研讨会论文汇编＂６１．
【专题报告ｌ乙型肝炎病毒Ｂ基因型与Ｃ基因型
ｐｒｅＣ／Ｃ区重组的研究
广州第一军医大学南方医院感染内科骆抗先刘志华何海棠彭士力戴炜梁蔚芳侯金林
乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）可分为Ａ—Ｆ６个基因型，基因型间全基因核苷酸序列差异大于８％。最近，Ｓｔｕｙｖｅｒ和Ａｒａｕｚ—Ｒｕｉｚ又发现了两个新的基因型，即Ｇ和Ｈ。ＨＢＶ基因型有不同的地理分布，其中Ｂ型和Ｃ型主要分布于亚洲。某些基因型中又包括不同的亚型，例如，Ａ型可分为亚型Ａ和Ａ。，Ｂ型中包括Ｂｊ和Ｂａ两个亚型，Ｃ型又可分出Ｃｑ－亚型。一些ＨＢＶ基因亚型可能来源于重组病毒株。
当某一基因型全基因组序列有一段与另外一个基因型序列的相应部分相同的杂合结构，则认为这一序列可能发生了重组，这种重组在ＨＢＶ的进化过程中可能会经常发生。Ｂｏｗｙｅｒ和Ｓｉｍ对ＧｅｎＢａｎｋ中的ＨＢＶ全基因组序列进行了分析，发现了一些杂台结构并且发现ＨＢＶ基因组核心区在Ｂ型和Ｃ型之间互相转换。ＡｌｉＦａｒｅｓ和Ｈｏｌｍｅｓ的研究表明基因型Ａ和Ｄ之间，Ｂ和Ｃ之间发生了基因重组。
越来越多的资料提示基因型，亚型和重组可能会影响病毒的生物学特性和感染者的临床结局。例如，Ｃ基因型感染者与Ｂ基因型相比，ＨＢｅＡｇ携带的时间较长，肝脏损伤也较重，此外，重组Ｂ基因型可能与临床疾病的严重性有关。ＨＢＶ在中国有很高的流行率，但是对基因型深入的研究非常少。本文对来源于华人的ＨＢＶ全基因组序列进行了分析。因为在中国Ｂ和Ｃ型最为常见我们主要对Ｂ型和Ｃ型之间的重组进行了研究。为了论述这一问题，我们筛选了Ｂ型和ｃ型以及Ｂ／Ｃ重组体，之后又对基因组全长和局部进行了进化分析，定位了Ｂ基因型的杂合区。此外，我们还对ＨＢＶＣ基因区的选择性压力进行了分析，探讨重组发生的机理。
材科和方法
１－样本和序列：为筛选ＨＢＶＢ型和Ｃ型的重组和共感染，在全国各地收集了１０６例慢性ＨＢｖ携带者的血清。
２．ＨＢＶＤＮＡ的抽提，扩增及测序用ＤＮＡ抽提试剂盒ＡｃｕＧｅｎＡｍｐｌｉＳｅｎｓｏｒ（ＢｉｏｔｒｏｎｉｃｓＣｏｒｐ，ＵＳＡ）从
５０ｍｌ血清中抽提总ＤＮＡ。分别用Ｓ区和Ｃ区引物扩增Ｓ区和Ｃ区ＤＮＡ片段。Ｓ区引物序列如下：Ｓｅｎｓｅ５。一ＧＣＧＧＧＧＴＴＴＴＴＣＴＴＧＴＴＧＡ一３’（ｎｔ２０３—２２１）；
ａｎｔｉｓｅｎｓｅ５。一ＧＧＧＡＣＴＣＡＡＧＡＴＧＴＴＧＴＡＣＡＧ一３’（ｎｔ７８８一ｒ６９）。
Ｃ区引物序列为：
ｓｅｎｓｅ５’一ＣＴＡＧＧＡＴＣＣＣＡＡＣＴＴＴＴＴＣＡＣＣＴＣＴＧＣ一３’（ｍｒ１８１７—１８３５），
ａｎｔｉｓｅｎｓｅ５。一ＧＣＴＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＣＡＴＴＧＡＧＡＴＴｃＣｃＧ一３ｌ（ｎｔ２４５２—２４３６）。
ＰＣＲ扩增３．２ｋｂ的全长ＨＢＶ基因组，引物序列如下：
ｓｅｎｓｅ５’～ＣＣＧＧＣＧＴＣＧＡＣＧＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＡＣＣＴＣＴＧＣＣＴＡＡＴＣＡ一３。（ｎｔｌ８２１—１８４１）Ｉ
ａｎｔｉｓｅｇｓｅ５’一ＣＣＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＣＴＣＴＴＣＡＡＡＡＡＧＴＴＧＣＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧ～３’（ｎｔｌ８２３—１８０６）。
扩增产物用小量胶回收试剂盒（ＱｉａｇｅｎＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ）回收，然后克隆至ｐＭＤｌ８一Ｔ载体上，操作按说明书进行。
３·基因型Ｂ、Ｃ和Ｂ／Ｃ重组体的筛选：分别以上述引物用ＰＣＲ方法扩增Ｓ区和Ｃ区片段，扩增产物用限制性片段多态性（ＲＦＬＰ）法进行分析：ＢＮＮＮＳ区５８６ｂｐ片段用ＢｓｒＩ酶切为１２６ｂｐ和４５９ｂｐ两个片段，Ｃ基因型无此酶切位点，ｃ基因型ｃ６３６ｂｐ片段用ＳｔｕＩ酶切为５２４和１１２ｂＤ两个片段，而Ｂ基因型无此酶切位点。
４·进化分析：ＨＢＶ全基因序列用ＣＬＵＳＴＡＬＷ软件Ⅳ１．７ＥｕｒｏｐｅＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙ））对准
．６２．
专题报告
后，用ＰＨＹＬＩＰ（ｖｅｒｓｉｏｎ３．５ｃ，Ｆｅｌｓｅｎｓｔｅｉｎ，１９９５）软件进行进化分析。先用ＳＥＱＢＯＯＴ程序进行ｂｏｏｔｓｔｒａｐ分析，复制出１０００套对准序列的文件，然后再用ＤＮＡＤＩＳＴ计算进化距离，用ＮＥＩＧＢＯＵＲ根据距离矩阵获得系统树，最后用ＣＯＮＳＥＮＳＥ得到严格一致树。进化树用ＴｒｅｅＶｉｅｗ软件查看。
我们分别用ｓ基因区（ｎｔ．２８１—７７０）和ｃ基因区（ｎｔ．［７４２－２４５２）进行进化分析，以筛选具有重组片段的ＨＢＶ全基因组。
５．基因重组的证据：用进化分析进行初步的筛选之后。对可能的重组序列进行迸一步的分析。用ＳｉｍＰｌｏｔ软件中的ｂｏｏｔｓｃａｎｎｉｎｇ程序分析重组发生的位置。四条序列用来分析进化信息位点（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅｓｉｔｅｓ）：一条假定的重组序列，两条Ｂ型和Ｃ型的参考序列，还有一条Ｆ基因型作为组外序列（ｏｕｔｇｒｏｕｐｓｅｑｕｅｎｃｅ）。
６．分析选择压力：用ＰＡＭＬ软件包中的ＣＯＤＥＭＬ程序，以最大似然法分析作用于重组序列的选择性压力。在这一方法中，用不同的模型计算误义替代（ｄＮ）和同义替代（ｄＳ）的数目，该方法允许∞值，即ｄＮ／ｄＳ的比率，在不同的位点可以发生变化。模型Ｍ０假定所有的位点的∞值都相同，模型Ｍ１将所有的位点分为两类。即保守位点（ｐ０），∞０为０，和中性位点（ｐ１），∞１为ｌ，模型Ｍ２加入另外一类位点，其∞值可以大于ｔ；模型Ｍ３提供了一个更为敏感的检验阳性选择的方法，可预先将所有位点分为ｋ类（通常为３类）；模型Ｍ７用离散分布来描述各个位点的∞值，共分ｌＯ个类别，所有类别的ｔｏ值均小于１，模型Ｍ８与Ｍ７的不同之处在于包括一类∞值大于１的位点。用ＬＲＴ（１ｉｋｅｌｉｈｏｏｄｒａｔｉｏｔｅｓｔ）法对包含阳性选择位点的模型（Ｍ２，Ｍ３ａｎｄＭ８）和不包含阳性选择位点的模型（ＭＯ，Ｍ１，ＭＴ）进行比较，以判断是否存在阳性选择压力。
７．统计分析：用Ｆｉｓｈｅｒ精确概率法和ｘ２检验进行统计学分析。
结果
１．基因型和亚型：在用ＰＣＲ—ＲＦＬＰ法分析的１０６个病人的ＨＢＶ序列中，６９个为Ｂ型，３３个为Ｃ型，还有４个未分型。基因型和亚型用全基因序列进行进化分析。在所有５３条全基因组序列中，２３条来自于本研究中ＲＦＬＰ筛选的血清标本，３０条来自ＧｅｎＢａｎｋ（表１）。这５３条全基因组序列包括１９条Ｂ型，３３条Ｃ型和１条Ｄ型（图ＩＡ）。总体来看，在总共１３６个病人中，Ｂ型有７３（５３．７％）个，Ｃ型５８（４２．６％）个，Ｄ型只有１个。
Ｔｍｂｌ９１．ＨｅｐａｔｉｔｉｓＢ＇ｖｉｒｕｓｆｕｌｌ－ｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＣｈｉｎｅｓｅｏ—ｇｍＡｃｃｅｓｓｉｏｎｎｏＧｅｎｏｔｙｐｅＡｒｅａＲｅｆｅｒｅｎｃｅ
ＡＦｌ００３０８－９Ｂ（２ｓｔｒａｉｎｓ）ＡＦｌ８２８０２５Ｃ（４ｓｔｒａｉｎｓｌＡＦ２３３２３６Ｃ
ＡＦ２８０８１７Ｄ
ＡＦ２８２９１７Ｂ
ＡＦ２８２９１８Ｃ
ＡＦ３６３９６ｌ一３ｃｆ３ｓｔｒａｉｎｓ）ＡＦ３８４３７１２Ｃ（２ｓｔｒａｉｎｓ）ＡＦ４１１４０８１２ｃ（５ｓｔｒａｉｎｓ）ＡＦ４５８６６４－５Ｃ（２ｓｔｒａｉｎｓ）ＡＦ４６１０４３Ｃ
ＡＦ４７３５４３Ｃ
ＡＦ４７９６８４Ｂ
ＡＦ５３３９８３Ｃ
ＡＹ０４０６２７Ｃ
ＡＹ０５７９４７８Ｃｆ２ｓｔｒａｉｎｓ）ＡＹ０６６０２８Ｃ
ＡＹ２１７３５５－６８ＡＹ２１７３７０Ｂ（１５ｓｔｒａｉｎｓ）Ｓｈａｎｇｈａｉ
Ｓｈａｎｇｈａｉ
Ｆｕｊｉａｎ
Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ
Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ
Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ
Ｂｅｔｊｉｎｇ
Ｂｅｉｊｉｎｇ
Ｓｈａｎｇｈａｉ
Ｓｈａｎｇｈａｉ
bootstrappedＢｅｉｊｉ＆ｇ
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Ｓｈａｎｇｈａｉ
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ＣｕｉＣ．ｅｔａｌ
ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ
ｐｒｅｓｅｎｔｓｔｕｄｙ
ＪＭｅｄＶｉｒｏｌ，２００１，６４：２９９
ＣｈｉｎＪＭｉｃｒｏｂｉ０１Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００２１２２：２６９
ＪＶｉｒｏｌ，２００１１７５：１１８”
ＪｇｅｎＶｉｒｏｌ，２００２１８３；２７７３
第四届全国肝脏疾病学术研讨会论文汇编．６３
值得注意的是，在进化树上所有华人Ｂ基因型形成一个与Ｂ基因原型（Ｄ２３６７７－８ｆｒｏｍＪａｐａｎ）分离的分枝，并且与ｃ型非常接近，ｂｏｏｔｓｔｒａｐ值为１００。因此，华人的Ｂ基因型是Ｂ基因型的一个亚型，与Ｃ型相关。
２．Ｂ型和Ｃ型的重组：起初我们对同一条序列的不同区段进行基因分型，寻Ｂ／Ｃ基因型的重组序列。用
图１Ａ
Ｆ础一ｇｅｎｏｍｅｂｏｏｔｓｔｒａｐｐｅｄｔｒｅｅｉｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｏｎＨＢＶｓｔｒａｉｎｓｏｆＣｈｉｎｅｓｅｏｒｉｇｉｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ（ｉｎｂｏｌｄｆａｃｅ）ａｎｄｒｅｔｒｉｅｖｅｄｆｒｏｍＧｅｎＢａｎｋ．（Ｂ）Ｓｕｂ～ｇｅｎｏｍｅｓｏｆｔｈｅｍａｒｅａｌｓｏｃｏｔｌｓｔｒｕｃｔｅｄ，ｂａｓｅｄ
ｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆ（ａ）ａｐａｒｔｏｆｔｈｅＳｒｅｇｉｏｎ（ｎｔ２８１—７７０）ｌ（ｂ）ａｐｏｒｔｉｏｎｇｅｎｅｒａｌｌｙｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓｔｏｔｈｅｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎ（ｎｔ１７４２２４５２）．Ｔｈｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｅ口ｕｅｎｏｅｓ（ｉｎ
ｉｔａｌｉｃｓ）ｆｒｏｍＧｅｎＢａｎｋｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｏｆｖａｒ／ｏｕｓｇｅｎｏｔｙｐｅｓａｒｅａ／ｓｏｉｎｃｌｕｄｅｄ．Ｂｏｏｔｓｔｒａｐｖａｌｕｅｓａｒｅｓｈｏｗｎ
ａｌｏｎｇｅａｃｈｍａｉｎｂｒａｎｃｈ．
．６４．专题报告
ＲＦＬＰ法筛选，如果某一序列的Ｓ区属于Ｂ型而ｐｒｅＣ／Ｃ区属于Ｃ型，就认为这一序列可能是重组序列。本文中７３条Ｂ型ＨＢＶ序列都含有ｃ基因型的ｐｒｅ—Ｃ／Ｃ杂合片段，因此，这些Ｂ型序列可能都是重组体。已知基因型Ｂ／Ｃ重组只发生在Ｃ区，因此我们分别用两个不同的区段来进行进化分析：一段是ｐｒｅＣ／Ｃ区（ｎｔ．１７４２２４５２），另一段是Ｓ区（ｎｔ．２８１７７０）。结果表明一部分ＨＢＶ序列的ｓ区和ｐｒｅＣ／Ｃ区分别属于不同的基因型（图１Ｂ），进化分析结果与ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析一致。我们注意到，重组现象仅限于Ｂ基因型与Ｃ基因型的ｐｒ
ｅ－Ｃ／Ｃ区重组，而没有发现ｃ基因型与Ｂ基因型的ｐｒｅ—Ｃ／Ｃ区重组。
３．重组位点的确定：我们用ＳｉｍＰｌｏｔ软件中的ｂｏｏｔｓｃａｍｆｉｎｇ程序对ＩＩＢＶ全序列的重组位点进行更加精确的
（ａ）
囤１ＢＳｕｂ—ｇｃｎｏｍ％ｏｆｔｈｅｍａｒｅａｌｓｏｃｏｒｌＳｌｔｍｃｔｅｄ，ｂａｓｅｄｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆ（ａ）ａｐａｒｔｏｆｔｈｅＳｒｅｇｉｏｎ（ｎｔ２８ｌ一７７０）；（ｂ）ａｐｏｒｔｉｏｎｇｅｎｅｒａｌｌｙｃｏｒｒｅｓＩｘｍｄｓｔｏｔｈｅｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎ（ｎｔ１７４２２４５２）．Ｔｈｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（ｉｎｉｔａｌｉｃｓ）ｆｒｏｍＧｅｎＢａｎｋｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｏｆｖａｒｉｏｕｓｇｅｎｏｔｙｐｅｓａｒｅａｌｓｏｉｎｃｌｕｄｅｄ．ＢｏｏｔｓｔｒａＤｖａｌｕｅｓａｒｅｓｈｏｗｎａｌｏｎｇｅａｃｈｍａｉｎｂｒａｎｃｈ．
第四届全国肝脏疾病学术研讨会论文汇编．６５，定位（图２）。
５００１．０００１．５∞２．０００２．５００３．０００Ｐ磊两习｜＝是嚣ｌＬ－＿＿＿－＿－一
圈２ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｉｍｉｌａｒｉｔｙｏｆｇｅｎｏｔｙｐｅＢａｎｄＣｓｔｒａｉｎｓｗａｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｕｓｉｎｇＳｉｍＰｌｏｔｐｒｏｇｒａｍａｎｄｂｏｏｔｓｃａｎｎｉｎｇｐｒｏｃｅｄｕｒｅ．Ｆｏｕｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｒｅｕｓｅｄｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇｔｈｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅｓｉｔｅｓ：Ｏｎｅｐｕｔａｔｉｖｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｂｏｔｈｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＢａｎｄＣ，ａｎｄｏｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｇｅｎｏｔｙｐｅＦａｓａｋｎｏｗｎｏｕｔｇｒｏｕｐ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅｓｉｔｅｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｗｈｅｒｅｔｗｏｓｅｑｕｅｎｃｅｓｓｈａｒｅｄｏｎｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅａｎｄｔｈｅｏｔｈｅｒｔｗｏｓｈａｒｅｄａｎｏｔｈｅｒ．Ｔｈｅｍａｘｉｍｕｍｃｈｉｓｑｕａｒｅｄｍｅｔｈｏｄｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｂｒｅａｋｐｏｉｎｔｓ．ａｎｄｔｈｅＰｖａｌｕｅｏｆｔｗｏｐｏｉｎｔｓｗａｓ＜０．０１．
所有１９条Ｂ型序列的ｐｒｅ—Ｃ／Ｃ区被Ｃ型相应部分替代。两个重组位点之间的杂合片段的位置很少发生改变，１４条序列的杂台片段的５Ｉ端位于ｎｔ１７４２，９条序列的杂合片段的３Ｉ端位于ｎｔ２４９５，还有５条位于ｎｔ２５５０。大部分杂合片段的长度为７５４ｂｐ或８０９ｂｐ。杂合片段与Ｂ型相应部分的同源性为８８．６－９２．２％，而与Ｃ型相应部分的同源性为９４．９－９８．３％。此外，有３条Ｃ型序列ＡＦ２３３２３６，ＡＦ４６１０４３和ＡＹ０５７９４８分别包含来自于Ｂ型和Ｄ型的杂合片段，但这些杂合片段均不在ｐｒｅ—Ｃ／Ｃ区范围内（表２）。
４．重组序列的阳性选择压力我们分析了是否有阳性选择压力影响基因型之间的重组。我们选择Ｍ０，Ｍ１，Ｍ２，Ｍ３，Ｍ７和Ｍ８五个模型模拟∞值的分布，根据每个模型的ｌ值（相似值）用统计学方法对上述模型进行两两比较，结果Ｍ２，Ｍ３，Ｍ８三个支持附ｌ生选择压力的模型的１值均高于Ｍ０，Ｍｌ和Ｍ７三个不支持阳性选择压力的模型（表３）。分析结果表明在这一区域存在阳性选择压力。
讨论
虽然ＨＢＶ在中国有很高的流行率，在庞大的感染人中流行的ＨＢＶ基因型和亚型却比较单一。在总共１３６条ＨＢＶ序列中有１０６条序列来自于本研究中的病人，另外有３６条华人ＨＢＶ序列来自ＧｅｎＢａｎｋ，除了一条序列为Ｄ型，其他序列都是Ｂ型或Ｃ型，其中包括在西藏分离的与Ｄ型重组的Ｃ型。结果说明基因型有显著的地区性分布，而且在历经长时间的感染和广泛的传播之后仍然相对稳定。
最近，Ｓｕｇａｕｃｈｉ提出亚洲的ＨＢＶＢ基因型可以分为两类：一类是原型Ｂ基因型只在日本流行，另一类是与Ｃ基因型重组的Ｂ型普遍存在与亚洲。我们的研究结果与这一报道大致相同。在全国各地收集ＨＢＶ感染者血清，进行基因型的鉴定，发现Ｂ型ＨＢＶ序列无一例外都是Ｂ／Ｃ重组体，在进化关系上华人的Ｂ型序列与Ｃ型接近，在分别以ｓ区和ｐｒｅＣ／Ｃ区序列构建的进化树上，同～重组Ｂ型序列的位置并不相同。这些发现提示这

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