不同电转仪的电转参数、质粒用量和拓扑结构对猪胎儿成纤维细胞转染效率的影响
钟翠丽;李国玲;莫健新;全绒;王豪强;李紫聪;吴珍芳;张献伟
【摘 要】To obtain an ideal transfection efficiency of porcine fetal fibroblasts,fluorescence activated cell sorting (FACS) was used to optimize parameters for transfection of porcine fetal fibroblasts (PFFs) with ECM(R) 830,NEPA 21 and NucleofectorTM 2b in different conditions such as electroporation parameters,plasmid dosages and topological structures.The results show that the optimum poring pulse parameter of NEPA 21 is voltage 200 V,continuous 3 ms,interval 50 ms,3 times,voltage attenuation range of 10％;and the transfection efficiency of NucleofectorTM 2b is highest under U-023 program.Under the optimum conditions,FACS analysis demonstrates that NucleofectorTM 2b and ECM(R) 830 have the highest transfection efficiency when transfecting 10 μg supercoiled plasmids into PFFs,and 8 μg for NEPA 21.Supercoiled plasmids show higher transfection efficiencies than linearized plasmids.Moreover,NucleofectorTM 2b has the highest transfection efficiency among the three electroporation instruments.This study paves the way to generat
e transgenic or gene editing pigs with high efficiency.%为获得猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs)最佳的电转染效率,本研究利用荧光激活细胞分选技术(fluorescence activated cell sorting,FACS)辅助优化NEPA 21和NucleofectorTM 2b两种电转仪电转染PFFs细胞的参数,比较不同质粒用量和拓扑结构在ECM(R) 830、NEPA 21和NucleofectorTM 2b中的转染效率.结果显示:NEPA 21电转PFFs的最佳穿孔参数为脉冲电压200 V,脉冲长度3 ms,脉冲间隔50 ms,脉冲次数3次,脉冲电压衰减幅度10％;NucleofectorTM 2b在U-023的转染参数下达到最高转染效率.ECM(R) 830和NucleofectorTM 2b的最适质粒用量都为10 μg,而NEPA 21为8μg;超螺旋质粒比线性化质粒的转染效率更高,且3种仪器中NucleofectorTM 2b转染效果最佳.本研究综合考虑电转仪、电转参数、质粒用量和拓扑结构的影响因素以优化PFFs的电转条件,为高效制备转基因猪及基因编辑猪的研究奠定基础.
【期刊名称】《遗传》
【年(卷),期】2017(039)010
【总页数】9页(P930-938)
【关键词】电转染;猪胎儿成纤维细胞;ECM(R) 830;NEPA 21;NucleofectorTM 2b
【作 者】钟翠丽;李国玲;莫健新;全绒;王豪强;李紫聪;吴珍芳;张献伟
【作者单位】华南农业大学国家生猪种业工程技术研究中心,广州510642;华南农业大学国家生猪种业工程技术研究中心,广州510642;华南农业大学国家生猪种业工程技术研究中心,广州510642;华南农业大学国家生猪种业工程技术研究中心,广州510642;华南农业大学国家生猪种业工程技术研究中心,广州510642;华南农业大学国家生猪种业工程技术研究中心,广州510642;华南农业大学国家生猪种业工程技术研究中心,广州510642;广东温氏食品集团股份有限公司,新兴527400;华南农业大学国家生猪种业工程技术研究中心,广州510642;广东温氏食品集团股份有限公司,新兴527400
【正文语种】中 文
随着转基因技术的发展，转基因猪的制备体系逐渐完善，但是制备效率低下仍然大大限制了转基因技术的应用。研究表明，转基因效率与猪体细胞克隆的供体细胞有关[1]，而目前猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts, PFFs)是使用最广泛的猪体细胞克隆供体细胞。Liu等[2]对比PFFs、成体成纤维细胞、猪成体脂肪前体细胞和猪成体血间充质细胞的克隆效率发现，虽然PFFs的囊胚率为30.38%，低于其他几种细胞(成体成纤维细胞、猪成
体脂肪前体细胞和猪成体血间充质细胞分别为37.94%、34.65%和34.87%)，但是其怀孕率和克隆效率显著高于其他细胞，分别为74.19%和1.5%；另外，PFFs供体细胞制备克隆胚胎后期发育异常率远低于其他几种细胞(PFFs、成体成纤维细胞、猪成体脂肪前体细胞和猪成体血间充质细胞分别为10.87%、56.57%、24.39%和51.85%)。目前，已有多篇以PFFs细胞为供体的转基因猪的报道，如2014年Li等[3]运用PFFs成功制备世界首例ROSA26定点基因敲入猪；2016年Lai等[4]通过CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术将Oct4-tdTomato报告基因转染至PFFs并成功制备基因敲入猪。因此，研究PFFs细胞的制备效率对提高转基因效率具有重要意义。
转染效率是限制转基因细胞制备的主要因素之一，据报道PFFs的脂质体转染效率为22.2%[5]。除了脂质体转染法，目前PFFs转染方法还包括碳酸钙化学法和电穿孔法等。覃兆鲜等[6]使用脂质体法和碳酸钙法转染成功，获得PFFs阳性细胞，但转染效率都比较低。与前两种方法相比，电穿孔法更适用于PFFs等难转染的细胞[7]。电穿孔法主要通过物理电流击穿细胞膜甚至细胞核，形成瞬时孔隙，外源DNA可通过这些孔隙进入细胞甚至细胞核内[8]。这种方法快速、简便易行、毒性小、转染效率较高，转染效率在30%~90%之间[9~11]，而且不同的电转仪的转染效率差别较大。电转仪种类繁多，例如早期电转仪ECM® 830(BTX，
美国)，近年来出现的新型电转仪NEPA 21(NEPA GENE，日本)和Nucleofector™ 2b(LONZA，德国)等。NEPA 21高效基因转染系统含有反向导入及电压衰减的电转程序设计，具有转染效率高、存活率高和不需要特殊转染试剂的特点。而配合专用转染试剂盒的Nucleofector™ 2b则具有转染效率高、DNA直接入核和简单易用的优势。目前ECM® 830是运用比较成熟的电转仪，虽然可以借鉴Ross等[9]全面优化的ECM® 2001电转PFFs的最佳参数(脉冲电压300 V，脉冲长度1 ms，脉冲次数3次)，但仍需进一步探索质粒的用量和拓扑结构对PFFs的转染效率的影响。虽然已报道了Nucleofector™ 2b转染PFFs的最佳程序，但是没有进一步综合探讨电转程序、质粒的用量和拓扑结构对PFFs转染的影响[10]。此外，NEPA21主要用于神经干细胞体外电转染，但目前还没有报道用于PFFs的电转染[11,12]，因此需要进行在电转参数、质粒的用量和拓扑结构等方面的实验优化。本研究通过优化不同电转仪的电转参数、质粒的用量和拓扑结构，综合评估电转PFFs的最佳电转仪及其电转条件，为高效率、低成本制备转基因猪奠定基础。
电转仪ECM® 830购自美国BTX公司；电转仪Nucleofector™ 2b购自德国LONZA公司；NEPA21购自日本NEPA GENE公司。PFFs细胞由广东温氏食品集团股份有限公司提供；质粒pPB-UBC-EGFP (7.6 kb)由英国Wellcome Trust Sanger Institute提供。Opti-MEM®ⅠR
educed Serum Medium购自Thermo Fisher Scientific(美国)；Nucleofector™ 2b电转液Basic Nucleofector Kit for Primary Mammalian Fibroblasts购自德国Amaxa公司；Endo-free Plasmid Maxi Kit购自美国Omega；FastDigest® NotⅠ限制性内切酶购自Thermo Fisher Scientific(美国)；澳洲胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自Gibco(美国)；Countess® II FL全自动细胞计数仪购自Life invitrogen(美国)。
1.2.1  质粒准备
pPB-UBC-EGFP依照Endo-free Plasmid Maxi Kit说明书进行抽提，取部分超螺旋pPB-UBC-EGFP质粒DNA，用FastDigest® NotⅠ限制性内切酶酶切，纯化回收，制备线性化的pPB-UBC-EGFP质粒DNA备用。
1.2.2  PFFs电转染步骤及检测方法 
PFFs细胞经解冻和复苏培养后，传代至含10 mL 完全培养基(12%FBS)的10 cm培养板，于39℃、5%CO2培养箱中培养至汇合度达80%~90%，经0.05%胰酶消化后进行细胞计数。吸取1×106个细胞悬液至新的离心管中，离心后弃上清，分别根据表1中处理组1和处
理组2对应的电转仪添加相应的电转预混液，制成单细胞悬液(空白组仅添加100 μL相应体积的电转液和水，不电转)转至2 mm间距的无菌电转杯中，根据不同仪器设定的电转参数进行电转。然后转移所有细胞至6孔板，添加2 mL/孔12% FBS的完全培养基，置于39℃、5%CO2的培养箱中培养。
电转后立即吸取少量细胞悬浮液进行台盼蓝染。细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9:1混合后加样到一次性Countess®细胞计数板上。在3 min内使用Countess®Ⅱ FL全自动细胞计数仪(Life Invitrogen，美国)分析细胞存活率。
电转6 h后更换成含有终浓度100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、12% FBS的DMEM完全培养基继续培养。电转48 h后用0.05%胰酶消化细胞，1000 r/min离心5 min，添加1 mL/孔PBS重悬，利用荧光激活细胞分选技术(fluorescence act­ivated cell sorting, FACS)检测表达绿荧光细胞数量，计算转染效率(绿荧光细胞数/总细胞数)。
1.2.3  电转参数优化
ECM® 830电转PFFs的最佳电转参数可借鉴Ross等[9]研究结果(脉冲电压300 V，脉冲长度
1 ms，脉冲次数3次)，而NEPA 21和Nucleofector™ 2b电转PFFs细胞的优化参数尚无报道。为优化NEPA 21和Nucleofector™ 2b转染PFFs细胞的最佳参数，本研究首先将转染实验分为两个独立的处理组，即NEPA 21组和Nucleofector™ 2b组，每组设定1个对应的空白组(仅添加100 μL相应体积的电转液和水，不电转)。根据电转仪NEPA 21设定的电转参数将NEPA 21组又分为4个小组(NEPA-1、NEPA-2、NEPA-3和NEPA-4)(表2)，根据电转仪Nucle­ofector™ 2b推荐的原代动物成纤维细胞电转参数又将其设置为A-033组和U-023组。每组处理重复3次。电转步骤及检测见1.2.2。此外NEPA 21的电转液为无血清Opti-MEM，而Nucleofector™ 2b的电转液为Basic Nucleofector Kit for Primary Mammalian Fibroblasts中Nucleofector™ Solution和Supplement按比例4.5:1混合的溶液。

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