实验研究
㊀基金项目：国家自然科学基金资助项目(Ｎｏ.８１９６０８１３)
㊀作者简介：李成蹊ꎬ男ꎬ研究方向：骨与四肢关节及其相关疾病的临床和研究ꎬＥ－mail:136****8489＠１６３.ｃｏｍ
㊀通信作者：关智宇ꎬ男ꎬ主任医师ꎬ研究方向：骨伤科疾病的临床与研究ꎬTel:152****4285ꎬE －ｍａｉｌ:１０７６９０５４０＠ｑｑ.ｃｏｍ
基于网络药理学和分子对接方法探讨络石藤
类风湿关节炎的作用机制
李成蹊１ꎬ关智宇２ꎬ蒋太平１ꎬ刘志伦１ꎬ刘昭明１
(１.贵州中医药大学ꎬ贵州贵阳５５００００ꎻ２.贵州中医药大学第一附属医院骨科ꎬ贵州贵阳５５０００１)摘要：目的㊀基于网络药理学和分子对接方法探讨络石藤(ＣｈｉｎｅｓｅＳｔａｒｊａｓｍｉｎｅＳｔｅｍ)类风湿关节炎(ＲＡ)的可能机制ꎮ方法㊀首先利用数据库检索中药 络石藤 的化学成分ꎬ并通过中药系统药理学数据库与分析平台(ＴＣＭＳＰ)的类药性指数(ＤＬ)和药物口服生物利用度(
ＯＢ)划定范围ꎬ从该药物成分中进一步筛选其中的有效活性成分ꎮ再通过Ｇｅｎｅｃａｒｄｓ㊁ＯＭＩＭ数据库获取尽可能全面的类风湿关节炎靶点基因ꎬ从而确定药物与疾病可能存在的交集靶点ꎬ以此构建络石藤中活性成分与类风湿关节炎靶点的关系网络ꎬ筛选疾病的核心靶点ꎮ最后ꎬ对络石藤类风湿关节炎的潜在作用靶点进行富集分析ꎬ同时对核心靶点及其结合性良好的活性成分进行分子对接ꎮ结果㊀最终筛选得到络石藤９个活性成分ꎬ其中包括木犀草素㊁植物甾醇㊁伊博格碱等ꎻ涉及６７个类风湿关节炎相关靶点ꎬ核心靶点包括ＲＢ１㊁ＭＡＰＫ１㊁ＡＫＴ１㊁ＪＵＮ㊁ＩＬ－６㊁ＲＥＬＡ等ꎻ分子对接显示络石藤某些活性成分与类风湿关节炎核心靶点具有较好的结合活性ꎮ结论㊀络石藤可以作用于疾病核心靶点ꎬ发挥抗炎㊁调节免疫功能及调控细胞凋亡等作用ꎮ
关键词：络石藤ꎻ类风湿关节炎ꎻ分子对接ꎻ网络药理学
中图分类号:Ｒ２８５㊀文献标识码:Ａ㊀文章编号:２０９５－５３７５(２０２２)１２－０７７１－００６ｄｏｉ:１０.１３５０６/ｊ.ｃｎｋｉ.ｊｐｒ.２０２２.１２.００１
Ｂａｓｅｄｏｎｎｅｔｗｏｒｋｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｏｃｋｉｎｇａｐｐｒｏａｃｈｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍ
ｏｆａｃｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎｅｓｅＳｔａｒｊａｓｍｉｎｅＳｔｅｍｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ
ＬＩＣｈｅｎｇｘｉ１ꎬＧＵＡＮＺｈｉｙｕ２ꎬＪＩＡＮＧＴａｉｐｉｎｇ１ꎬＬＩＵＺｈｉｌｕｎ１ꎬＬＩＵＺｈａｏｍｉｎｇ１
(１.ＧｕｉｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＧｕｉｙａｎｇ５５００００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓꎬＴｈｅＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＧｕｉｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅꎬＧｕｉｙａｎｇ５５０００１ꎬＣｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｐｏｓｓｉｂｌｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＣｈｉｎｅｓｅＳｔａｒｊａｓｍｉｎｅＳｔｅｍｉｎｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｒｈｅｕｍａ￣
ｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ(ＲＡ)ｂａｓｅｄｏｎｎｅｔｗｏｒｋｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｏｃｋｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀Ｆｉｒｓｔｌｙꎬｔｈｅｃｈｅｍｉｃａｌｃｏｍｐｏ￣
ｓｉｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎｅｓｅＳｔａｒｊａｓｍｉｎｅＳｔｅｍｗａｓｓｅａｒｃｈｅｄｕｓｉｎｇｄａｔａｂａｓｅｓꎬａｎｄｔｈｅａｃｔｉｖｅｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓｗｅｒｅｆｕｒｔｈ
ｅｒｓｃｒｅｅｎｅｄｆｒｏｍｔｈｅｄｒｕｇｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｂｙｄｅｌｉｎｅａｔｉｎｇｔｈｅｒａｎｇｅｏｆｄｒｕｇ－ｌｉｋｅｉｎｄｅｘ(ＤＬ)ａｎｄｏｒａｌｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｄｒｕｇ(ＯＢ)ｏｎｔｈｅＴＣＭＳＰｐｌａｔｆｏｒｍ.ＴｈｅｎꎬｔｈｅＧｅｎｅｃａｒｄｓａｎｄＯＭＩＭｄａｔａｂａｓｅｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｏｂｔａｉｎｔｈｅｍｏｓｔｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅＲＡｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓｐｏｓｓｉｂｌｅꎬｓｏａｓｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｐｏｓｓｉｂｌｅｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎｔａｒｇｅｔｓｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｄｒｕｇａｎｄｔｈｅｄｉｓｅａｓｅꎬａｎｄｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｎｅｔｗｏｒｋｏｆｔｈｅａｃｔｉｖｅｉｎ￣ｇｒｅｄｉｅｎｔｓｉｎＣｈｉｎｅｓｅＳｔａｒｊａｓｍｉｎｅＳｔｅｍａｎｄｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓｔａｒｇｅｔｓꎬａｎｄｔｏｓｃｒｅｅｎｔｈｅｃｏｒｅｔａｒｇｅｔｓｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｔｈｅｄｉｓｅａｓｅ.ＦｉｎａｌｌｙꎬｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｔａｒｇｅｔｓｆｏｒＲＡｔｒｅａｔｍｅｎｔｗｅｒｅｅｎｒｉｃｈｅｄａｎｄａｎａｌｙｚｅｄꎬａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｏｃｋｉｎｇｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｆｏｒｔｈｅｃｏｒｅｔａｒｇｅｔｓａｎｄｔｈｅｉｒｗｅｌｌ－ｂｉｎｄｉｎｇａｃｔｉｖｅｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀ＴｈｅｆｉｎａｌｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｎｉｎｅａｃｔｉｖｅｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓｏｆＣｈｉｎｅｓｅＳｔａｒｊａｓｍｉｎｅＳｔｅｍꎬｉｎｃｌｕｄｉｎｇｌｉｇｎａｎꎬｐｈｙｔｏｓｔｅｒｏｌａｎｄｉｂｏｇａｉｎｅꎬｉｎｖｏｌｖｅｄ６７ＲＡ－ｒｅｌａｔｅｄｔａｒｇｅｔｓꎬａｎｄｔｈｅｃｏｒｅｔａｒｇｅｔｓｉｎｃｌｕｄ
ｅｄＲＢ１ꎬＭＡＰＫ１ꎬＡＫＴ１ꎬＪＵＮꎬＩＬ－６ꎬＲＥＬＡꎬｅｔｃ.ＭｏｌｅｃｕｌａｒｄｏｃｋｉｎｇｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｓｏｍｅａｃｔｉｖｅｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓｏｆＣｈｉｎｅｓｅＳｔａｒｊａｓｍｉｎｅ
ＳｔｅｍｈａｄｇｏｏｄｂｉｎｄｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｗｉｔｈｔｈｅｃｏｒｅｔａｒｇｅｔｓｏｆＲＡ.Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＣｈｉ￣ｎｅｓｅＳｔａｒｊａｓｍｉｎｅＳｔｅｍｃｏｕｌｄａｃｔｏｎｔｈｅｃｏｒｅｔａｒｇｅｔｓｏｆＲＡꎬｅｘｅｒｔｉｎｇａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙꎬｉｍｍｕｎｅｍｏｄｕｌａｔｉｎｇａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｅｆｆｅｃｔｓ.
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＣｈｉｎｅｓｅＳｔａｒｊａｓｍｉｎｅＳｔｅｍꎻＲｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓꎻＭｏｌｅｃｕｌａｒｄｏｃｋｉｎｇꎻＮｅｔｗｏｒｋｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ
㊀㊀现代医学认为ꎬ类风湿关节炎(ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒ￣ｔｈｒｉｔｉｓꎬＲＡ)是一种以侵袭性关节滑膜炎为主要症状的自身免疫系统疾病ꎬ其具体病因未明[１]ꎮ特征为身体多关节的对称性㊁侵蚀性炎症ꎬ临床表现有关节晨僵㊁肿胀㊁疼痛及功能障碍等症状(最常见于手㊁足小关节)ꎬ实验室检查可见血清类风湿因子阳性ꎮ如未得到恰当ꎬ可能造成患者永久性骨质破坏并最终出现残疾ꎬ甚至累
及脏器和神经系统而危及生命[２]ꎮ目前临床常见的ＲＡ药物的主要局限性在于单一的靶向作用ꎬ这使得它们虽然可在短期内改善患者的临床症状ꎬ但长期的效果往往欠佳ꎬ且存在的不良反应和较大的经济负担使得很多患者不能维持用药ꎮ故而探寻并利用长效㊁低毒㊁价廉的中草药对ＲＡ患者进行ꎬ一直是近些年来临床研究的一个热点ꎮ
ＲＡ属中医 痹症  尪痹 范畴ꎮ中医理论认为痹症是由于体虚之人受到风㊁寒㊁湿㊁热等邪气侵袭ꎬ进而使经络闭阻ꎬ气血运行不畅ꎬ所谓 不通则痛  不荣则痛 ꎬ最终导致肢体肌肉废用ꎬ关节红肿热痛㊁变形等症状的一种疾病ꎮ在长期的临床实践过程中ꎬ我国古代医家对此病有了较为系统的认知ꎬ在许多中医典籍中都有对类似病症的总结ꎮ«黄帝内经»最早提出了风㊁寒㊁湿三种外邪相合而致痹症ꎬ«素问 痹论»[３]曰: 风寒湿三气杂至合而为痹也 ꎻ对风湿的认知发展至宋代ꎬ有«太平圣惠方»云: 风湿腰痛ꎬ连腿膝ꎬ顽痹不能运动 ꎬ«太平惠民和剂局方»[４]又载: 体虚ꎬ风邪入血ꎬ肌肤顽痹 ꎬ都强调了体虚是痹病之根本原因ꎬ此后风湿之邪从外侵犯而成痹证ꎮ从古至今中医对ＲＡ的治法也以祛风胜湿ꎬ通络止痛为主ꎮ«中国药典»[５]记载络石藤为夹竹桃科植物络石[Ｔｒａｃｈｅｌｏｓｐｅｒｍｕｍｊａｓｍｉｎｏｉｄｅｓ(Ｌｉｎｄｌ.)Ｌｅｍ.]的干燥带叶藤茎ꎮ味苦ꎬ性微寒ꎮ归心㊁肝㊁肾经ꎮ有祛风通络ꎬ凉血消肿的功效ꎮ中医常将其用于风湿痹症㊁腰痹筋挛㊁红肿热痛㊁跌扑损伤等ꎮ«本草纲目»[６]有载: 络石ꎬ气味平和ꎬ其功主筋骨关节风热痈肿 ꎮ通过长期的临床实践ꎬ人们发现在古今众多经方运用过程中ꎬ络石藤往往可有效延缓各种关节炎症的发展ꎬ改善患者临床症状ꎮ但由于中草药的成分混杂㊁机制不明
等原因ꎬ其类似 黑箱理论 的运作形式在多种临床疾病过程中的作用依然受到质疑ꎮ本文旨在运用现代化的网络药理学和分子对接方法ꎬ分析络石藤所含的主要活性物质基础及其可能的作用机制ꎬ为明确络石藤对于ＲＡ的效果提供数据支持与理论依据ꎮ１㊀材料与方法
１.１㊀主要软件与数据库㊀Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ３.８.０㊁Ｒ语言㊁ｐｅｒｌｄｏｃｕｍｅｎｔ㊁ＣｈｅｍＢｉｏ３ＤＵｌｔｒａ㊁ＰｙＭＯＬ㊁ＡｕｔｏＤｏｃｋ￣Ｔｏｏｌｓ㊁Ｖｉｎａ㊁中药系统药理学数据库与分析平台(ＴＣＭＳＰ)㊁ＧｅｎｅＣａｒｄｓ基因数据库㊁在线人类孟德尔遗传数据库(ＯｎｌｉｎｅＭｅｎｄｅｌｉａｎＩｎｈｅｒｉｔａｎｃｅｉｎＭａｎꎬＯＭＩＭ)㊁ＰｕｂＣｈｅｍ数据库㊁Ｕｎｉｐｒｏｔ蛋白质数据库㊁ＳＴＲＩＮＧ蛋白互作关系数据库㊁ＰｕｂＣｈｅｍ有机小分子生物活性数据库㊁ＲＣＳＢ蛋白质数据库(ＰＤＢ)ꎮ１.２㊀络石藤活性成分及作用靶点的筛选㊀在ＴＣＭＳＰ中ꎬ以 络石藤 为检索词ꎬ获取络石藤已知的药物成分ꎬ将口服生物利用度大于等于３０％(ＯＢȡ３０％)ꎬ化合物类药性大于等于０.１８(ＤＬȡ０.１８)设定为筛选标准ꎬ得到络石藤所含化合物中活性度较高的成分ꎬ之后利用数据库进一步搜索这些成分所作用的靶点基因ꎬ再将药物所有的作用靶点导入ＵｎｉＰｒｏｔ数据库进行比对㊁去重后ꎬ获得络石藤可作用的靶点基因名称ꎮ
１.３㊀类风湿关节炎靶点的筛选㊀在ＧｅｎｅＣａｒｄｓ㊁ＯＭＩＭ两种数据库中同时检索关键词 ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ ꎬ将检索物种设定为 ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ(人类) ꎬ得到较为全面的ＲＡ疾病人源靶点基因ꎮ１.４㊀ 药物－活性成分－靶点－疾病 网络的构建㊀得到络石藤活
性成分作用靶点与ＲＡ潜在靶点基因后ꎬ运行ｐｅｒｌｄｏｃｕｍｅｎｔ程序获取 药物－疾病 交集靶点ꎬ再利用Ｒ语言将交集靶点输出为Ｖｅｎｎ图ꎬ运用Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ３.８.０软件将络石藤及其活性成分㊁ＲＡ及其靶点基因之间的作用关系进行可视化分析ꎮ１.５㊀靶蛋白互作网络(ＰＰＩ)的构建㊀检索ＳＴＲＩＮＧ数据库ꎬ导入 药物－疾病 交集靶点ꎬ生成蛋白互作网络(ＰＰＩ)后ꎬ将网络图保存为ＴＳＶ格式的数据文件后导入到Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ３.８.０中进行筛选ꎬ得到络石藤活性成分作用的核心靶点基因ꎮ
１.６㊀分子对接㊀首先使用ＰｕｂＣｈｅｍ数据库搜索核心靶点对应的活性成分ꎬ导入ＣｈｅｍＢｉｏ３ＤＵｌｔｒａ软件绘制活性成分的３Ｄ结构ꎬ得到小分子配体文件ꎮ之后从ＲＣＳＢ蛋白质数据库(ＰＤＢ)下载核心靶点的三维结构ꎬ用ＰｙＭＯＬ软件删除配体并除水ꎬ得到蛋白受体文件ꎮ将二者导入ＡｕｔｏＤｏｃｋＴｏｏｌｓ进行加氢修饰ꎬ设定搜索范围和评分参数ꎬ形成活性口袋ꎮ最后利用Ｖｉｎａ软件进行分子对接ꎮ
１.７㊀ＧＯ富集分析与ＫＥＧＧ通路富集分析㊀下载Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ程序包并利用Ｒ语言运行ꎬ对之前获取的 药物－疾病 交集靶点进行ＧＯ富集分析和ＫＥＧＧ通路分析ꎬ将阈值设定为Ｐ<０.０５以提高分析
准确性ꎬ将分析结果按照涉及的靶点数目从高到低进行排列ꎬ选取ＧＯ富集分析中生物过程(ＢＰ)㊁细
胞组成(ＣＣ)和分子功能(ＭＦ)的前１０个条目及ＫＥＧＧ通路富集的前２０个信号通路ꎬ进一步探讨络石藤ＲＡ的生物学过程及其作用的信号通路ꎮ２　结果
２.１㊀络石藤活性成分及作用靶点㊀通过ＴＣＭＳＰ数据库共检索出络石藤２５个已知化学成分ꎬ再将ＯＢȡ３０％和ＤＬȡ０.１８设置为筛选条件ꎬ最终得到９个活性度较高的化合物ꎬ可推测为络石藤活性成分(见表１)ꎮ将活性成分导入ＴＣＭＳＰ数据库ꎬ获取每个活性成分所作用的靶点基因ꎬ为避免不同活性成分存在重复的作用靶点ꎬ故将全部靶点基因利用ＵｎｉＰｒｏｔ数据库进行比对㊁去重ꎬ获得９０个络石藤ＲＡ的潜在靶基因名称ꎮ
表１㊀络石藤活性成分
化合物ＩＤ化合物名称生物利用度(ＯＢ)类药性
(ＤＬ)
ＭＯＬ０００３５９谷甾醇３６.９１０.７５ＭＯＬ０００４４９豆甾醇４３.８３０.７６ＭＯＬ０００５２２牛蒡子苷３４.４５０.８４ＭＯＬ０００５２５去甲汉黄芩素３９.４０.２１ＭＯＬ０００５２７木犀草素－４ᶄ－Ｏ－β－Ｄ－
葡萄糖苷３５.９４０.７９ＭＯＬ０００５２８老刺木碱４６.７６０.７８ＭＯＬ０００５２９伊博格
碱５０.５２０.６３ＭＯＬ０００５３３２(３Ｈ)－呋喃酮４０.１９０.８１ＭＯＬ０００００６木犀草素３６.１６０.２５２.２㊀类风湿关节炎靶点的筛选㊀在ＧｅｎｅＣａｒｄｓ数据库㊁ＯＭＩＭ数据库中检索关键词 ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ ꎬ物种设定为 ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ ꎬ得到ＲＡ的人源靶点基因４４２７个ꎬ结合络石藤ＲＡ的潜在靶点ꎬ运行ｐｅｒｌｄｏｃｕｍｅｎｔ取 药物－疾病 交集靶点ꎬ利用Ｒ语言输出为Ｖｅｎｎ图ꎬ发现６７个络石藤作用靶点与类风湿关节炎重合的靶点基因ꎮ
２.３㊀ 药物－活性成分－靶点－疾病 网络构建㊀将药物活性成分和疾病交集靶点导入Ｃｙｓｔｏｓｃｏｐｅ３.８.０软件ꎬ得到 药物－活性成分－靶点－疾病 网络图(见图１)ꎮ网络图中共包含１５８个节点ꎬ其中六边形代表药物ꎬ矩形代表药物活性成分ꎬ椭圆形代表靶点ꎬ菱形代表疾病ꎬ连接线表示两个元素之间存在相互关系ꎮ根据网络中络石藤活性成分与疾病靶点连接度的多少筛选出排名前四的有效活性分子ꎬ分别为木犀草素㊁伊博格碱㊁谷甾醇㊁豆甾醇ꎬ各有８个以上的靶点基因与这些成分发生作用ꎬ推测是络石藤在ＲＡ中起主要作用的活性成分ꎬ体现了中药多靶点的特性ꎮ２.４㊀靶蛋白互作网络(ＰＰＩ)的构建㊀检索ＳＴＲＩＮＧ数据库ꎬ将范围设为 Ｍｕｌｔｉｐｌｅｐｒｏｔｅｉｎｓ ꎬ物种设为 Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ ꎬ导入 药物－疾病 交集靶点ꎬ初步生成蛋白互作网络(ＰＰＩ)后ꎬ调整 ｍｉｎｉｍｕｍｒｅｑｕｉｒｅｄｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｃｏｒｅ 为０.９并隐藏游离靶点ꎬ其余参数为默认值ꎬ绘制更明晰的蛋白互作关系(见图２)ꎬ节点之间连线越粗代表互作关系越密切ꎮ将互
作网络保存为ＴＳＶ格式的数据文件ꎬ导入到Ｃｙｔｏ￣ｓｃａｐｅ３.８.０中对靶蛋白作用程度进行打分ꎬ筛选两次后得到６个蛋白互作网络核心基因(见图３)ꎬ分别为ＲＢ１㊁ＭＡＰＫ１㊁ＡＫＴ１㊁ＪＵＮ㊁ＩＬ－６㊁ＲＥＬＡꎬ确定为络石藤活性成分作用的核心靶点
ꎮ
图１㊀ 药物－活性成分－靶点－疾病
网络
图２㊀蛋白互作网络
(ＰＰＩ)
图３㊀蛋白互作网络核心基因筛选
２.５㊀分子对接㊀将筛选出的６个核心靶点与络石藤
活性成分进行分子对接验证ꎬ其结果见表２ꎬ可见木犀草素是与６个核心靶点对接的活性成分ꎬ运用Ｐｙ￣ＭＯＬ软件输出对接模式图(见图４)ꎮ分子对接的结合能(ａｆｆｉｎｉｔｙ)越小ꎬ表示配体与受体结合的越牢固ꎮ对接结果显示ꎬ络石藤活性成分与ＲＡ核心靶点的结合能介于－７.７ｋｃａｌ ｍｏｌ－１与－９.８ｋｃａｌ ｍｏｌ－１之间(低于－５.０ｋｃａｌ ｍｏｌ－１)ꎬ表明活性成分与核心靶点具有较好的结合活性ꎬ预测结果比较可靠ꎮ
表２㊀活性成分与核心靶点对接结果
核心靶点ＰＤＢ号活性成分结合能/ｋｃａｌ ｍｏｌ－１
ＲＢ１１ｇｕｘ木犀草素－７.７ＭＡＰＫ１４ｆｖ５木犀草素－９.１ＡＫＴ１３ｏ９６木犀草素－９.８ＪＵＮ５ｔ０１木犀草素－８.７ＩＬ－６７ｄｃ８木犀草素－８.２ＲＥＬＡ
３ｑｘｙ
木犀草素
－
７.７
图４㊀络石藤活性成分与ＲＡ核心靶点对接模式
２.６㊀ＧＯ富集分析与ＫＥＧＧ通路富集分析㊀将筛选出的６７个 药物－疾病 交集靶点进行ＧＯ富集分析与ＫＥＧＧ通路富集分析ꎬ制作富集图形ꎮ本次ＧＯ富集分析共显示１８８８个生物过程(ＢＰ)㊁８４个细胞组成(ＣＣ)㊁９１个分子功能(ＭＦ)ꎬ各取其中前１０个条目进行可视化分析(见图５)ꎮ交集靶点基因在ＢＰ富集过程中主要表现在对生物碱的反应(ｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏａｌｋａｌｏｉｄ)㊁肌肉细胞增殖(ｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ)㊁细胞对化学应激的反应(ｃｅｌｌｕｌａｒｒｅ￣ｓｐｏｎｓｅｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔｒｅｓｓ)㊁调节平滑肌细胞增殖(ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ)㊁对金属离子的反应(ｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｍｅｔａｌｉｏｎ)㊁腺体发育
(ｇｌａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ)㊁对氧化应激的反应(ｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｏｘｉｄａｔｉｖｅｓｔｒｅｓｓ)㊁对类固醇激素的反应(ｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｓｔｅｒｏｉｄｈｏｒｍｏｎｅ)㊁对活性氧的反应(ｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｒｅ￣ａｃｔｉｖｅｏｘｙｇｅｎｓｐｅｃｉｅｓ)等生物过程ꎻ在ＣＣ富集过程中主要表现为突触后膜(ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃｍｅｍｂｒａｎｅ)㊁突触膜(ｓｙｎａｐｔｉｃｍｅｍｂｒａｎｅ)㊁突触前膜(ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃｍｅｍｂｒａｎｅ)㊁细胞膜筏(ｍｅｍｂｒａｎｅｒａｆｔ)㊁细胞膜微区(ｍｅｍｂｒａｎｅｍｉｃｒｏｄｏｍａｉｎ)㊁细胞膜区(ｍｅｍｂｒａｎｅｒｅ￣ｇｉｏｎ)等细胞组成ꎻ在ＭＦ富集过程中主要表现在儿茶酚胺结合(ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｂｉｎｄｉｎｇ)㊁Ｇ蛋白偶联的胺受体活性(Ｇｐｒｏｔｅｉｎ－ｃｏｕｐｌｅｄａ
ｍｉｎｅｒｅｃｅｐｔｏｒａｃｔｉｖｉ￣ｔｙ)㊁药物结合(ｄｒｕｇｂｉｎｄｉｎｇ)㊁神经递质受体活性(ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｒｅｃｅｐｔｏｒａｃｔｉｖｉｔｙ)㊁肽结合(ｐｅｐｔｉｄｅｂｉｎｄｉｎｇ)等分子功能ꎮ
图５㊀络石藤ＲＡ的ＧＯ富集分析
本次ＫＥＧＧ通路富集分析显示了１２５条通路ꎬ取前２０个条目进行可视化分析(见图６)ꎮ交集靶点主要富集于ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ信号通路㊁多种癌症相关通路㊁人巨细胞病毒感染㊁乙型肝炎㊁ＨＩＦ－１信号通路㊁ＩＬ－１７信号通路㊁ＴＮＦ信号通路等ꎬ多为癌症㊁感染㊁炎症和免疫相关通路
ꎮ
图６㊀络石藤ＲＡ的ＫＥＧＧ通路富集分析
３　讨论
经过ＴＣＭＳＰ数据库筛选后ꎬ本次研究共得到络石藤中９个药动学特征良好的化合物作为潜在活性成分ꎬ通过 药物－活性成分－靶点－疾病 网络图反映
出其中木犀草素㊁伊博格碱㊁谷甾醇㊁豆甾醇４个成分
可能为发挥ＲＡ作用的关键成分ꎮ木犀草素是
一种天然黄酮类化合物ꎬ具有抗肿瘤㊁抗炎㊁抗病毒㊁
抗氧化㊁免疫调节等药理作用ꎮＡｚｉｚ等[７]通过体内及体外实验证实了木犀草素具有较好的抗炎作用ꎬ其主
要通过ＮＦ－κＢ㊁ＭＡＰＫ通路发挥作用ꎮ徐强等[８]认为木犀草素可以通过下调基质金属蛋白酶(ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓꎬＭＭＰｓ)的表达ꎬ防止软骨降解ꎬ促进新合成的细胞外基质(ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘꎬＥＣＭ)的
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积累ꎬ并抑制滑膜成纤维细胞增殖ꎬ最终缓解关节部
位的炎症反应ꎮ部分关于急性痛风性关节炎模型大
鼠的实验也证实了木犀草素缓解试验模型足踝关节
肿胀的作用ꎬ是通过下调ＩＬ－１β㊁ＩＬ－６㊁ＩＬ－１７㊁ＴＮＦ－α
等的水平达到的[９]ꎮ谷甾醇是植物甾醇的重要组成成分ꎬ其作用于多种慢性疾病ꎬ具有抗炎㊁抗氧化及
抗肿瘤等作用[１０]ꎮＬｉａｏ等[１１]发现β－谷甾醇可以通过抑制表皮细胞㊁巨噬细胞中炎症小体ＮＬＲＰ３的激活ꎬ来抑制ＣＡＳ１的产生及ＭＡＰＫ信号通路的活化ꎬ从而显著减少细胞中的ＴＮＦ－α㊁ＩＬ－１β㊁ＩＬ－６㊁ＩＬ－８生成以起到抗炎作用ꎮ曾莉萍等[１２]发现β－谷甾醇可使成骨细胞护骨素与破骨细胞分化因子的比值增高ꎬ发挥雌激素样作用ꎬ促进卵巢颗粒细胞分泌雌二醇ꎬ从而与骨膜上的雌激素受体结合ꎬ促进成骨作用以及抑制破骨作用来调节女性骨代谢的平衡ꎮ关于豆甾醇及伊博格碱的相关文献报道较少ꎬ豆甾醇的作用主要涉及抗癌方面ꎬ而伊博格碱主要用于阻断某些药物或的依赖性ꎬ本文不做详细讨论ꎮ故推测木犀草素和谷甾醇为络石藤抗ＲＡ的关键活性成分ꎮ
而分子对接的结果也表明ꎬ在通过ＰＰＩ网络筛选
出的核心靶点基因ＲＢ１㊁ＭＡＰＫ１㊁ＡＫＴ１㊁ＪＵＮ㊁ＩＬ－６㊁ＲＥＬＡ中ꎬ络石藤活性成分木犀草素与核心靶点具有较好的结合活性ꎬ进一步证实了络石藤药物成分可以与受体稳定结合并发挥ＲＡ的作用ꎬ为络石藤作用于核心靶点以干预ＲＡ病情提供了更多数据支持ꎮ在筛选出的核心靶点基因中ꎬ又以ＭＡＰＫ１㊁ＡＫＴ１㊁ＪＵＮ三个基因的自由度最高ꎮＭＡＰＫ(基质金属蛋白酶)信号通路是经典的炎性反应通路ꎬ有研究表明ꎬ对胶原诱导的关节炎大鼠给予ＭＡＰＫ信号转导通路抑制剂后ꎬ与未给信号通路抑制剂的对照组相比ꎬ给药组在抑制滑膜炎症㊁骨质破坏和关节软骨破坏的方面有显著效果[１]ꎮ说明该信号通路对炎症㊁增生和骨破坏这三大ＲＡ病理过程均起到重要的调节作用ꎮＡＫＴ１可通过磷酸化其下游底物来促进细胞生长㊁代谢㊁凋亡等重要的细胞生物学过程[１３]ꎮＪＵ
Ｎ(转录因子ＡＰ－１)主要由Ｃ－Ｆｏｓ家族和Ｃ－ｊｕｎ家族结合形成的二聚体构成ꎬＪＵＮ位于多条信号通路的下游ꎬ主要调控炎性因子(ＴＮＦ－α㊁ＩＬ－１β㊁ＩＬ－１㊁ＩＬ－６㊁ＩＬ－１７等)和金属蛋白酶(ＭＭＰｓ)等的释放ꎬ参与细胞增殖㊁分化㊁凋亡ꎬ影响机体的免疫和炎性反应[２]ꎮ
㊀㊀ＧＯ富集分析结果表明ꎬ络石藤对ＲＡ的过程包括了金属离子㊁蛋白质等多种物质的参与ꎬ涉及细胞器㊁细胞膜细胞ꎬ可影响肌肉细胞增殖㊁药物结合㊁神经递质受体活性㊁肽结合ꎬ对各种有机环状化合物反应㊁对生物碱反应㊁对非生物刺激反应㊁对类固醇激素反应和对含氧化合物等反应的一个复杂的过程ꎮＫＥＧＧ通路富集分析可归纳靶基因作用于疾病时所途径的信号通路ꎬ便于更加清稀㊁明确地总结药物发挥作用的过程ꎮＩＬ－１７在ＲＡ患者病理活检中均可检测到ꎬ且研究表明ＩＬ－１７是通过ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ途径刺激ＲＡ－ＦＬＳ分泌ＩＬ－６㊁ＩＬ－８及血管内皮细胞生长因子受体(ＶＥＧＦＲ)[１４－１５]ꎮ而更多研究还发现ꎬＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ可以通过影响ＦＬＳ的增殖与凋亡干预ＲＡ滑膜炎症ꎬ进行对ＴＮＦ－α诱导Ｂ淋巴细胞诱导成熟蛋白１(Ｂｌｉｍｐ１)表达的调控干预ＲＡ骨破坏ꎬ其参与了ＲＡ进展的全部过程[１６]ꎮ有研究表明[２]ꎬＲＡ成纤维样细胞异常增生ꎬ并展现出了类癌细胞特点ꎬＲＡ纤维样滑膜细胞异常增生可能与癌症相关通路有关联ꎬ络石藤对多种癌症相关通路的调控也可能对ＲＡ发挥作用ꎮ
综上所述ꎬ本研究利用网络药理学与分子对接方法ꎬ搜集到络石藤９种活性成分及可能作用的９０个潜在靶点ꎬ４４２７个ＲＡ疾病的相关靶点ꎬ其中包括 药物－疾病 交集靶点６７个ꎬ构建关于这些靶点基
因的蛋白互作网络(ＰＰＩ)ꎬ发现络石藤可能是通过作用于ＲＢ１㊁ＭＡＰＫ１㊁ＡＫＴ１㊁ＪＵＮ㊁ＩＬ－６㊁ＲＥＬＡ等靶点发挥对ＲＡ的作用ꎬ分子对接显示ꎬ其中发挥主要作用的活性成分为木犀草素ꎮ通过对核心靶进行ＧＯ富集分析和ＫＥＧＧ通路富集分析ꎬ络石藤可能通过调控ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ信号通路㊁癌症相关通路㊁细胞凋亡通路㊁ＩＬ－１７信号通路等通路ꎬ发挥抑制炎症反应㊁调节免疫功能及调控细胞凋亡等作用来类风湿关节炎ꎮ这些结果通过数据证明了络石藤ＲＡ的有效性ꎬ体现了中草药特定疾病可以发挥多种要素协同作用的特点ꎬ也说明网络药理学和分子对接方法运用于中医药研究的科学性和有效性ꎮ同时ꎬ本研究尚存在需要改进之处ꎬ如检索的数据库种类较少ꎬ所获取的信息可能不完全ꎬ获取的小分子配体及核心靶点数量有限ꎬ无法更加全面地揭示中草药的药理作用ꎻ作者查阅㊁引用的文献及凭借网络数据构建的框架㊁列表㊁绘图中存在对当前研究热点的倾向性ꎬ可能一定程度上影响到本次研究的(下转第７９０页)

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