miScript PCR 系统操作手册试剂盒成分：
miScript Reverse Transcription Kit
miScript Primer Assays
miScript SYBR® Green PCR Kit
10x miScript Primer Assay 和10x miScript Precursor Assay是干粉状的，需要稀释。首先短暂离心小管，然后加入550μl TE，pH 8.0，最后在漩涡震荡仪上4-6次。为了保持引物的活性，在冷冻条件下将稀释的引物分装成小管。
实验步骤：反转录反应
1、在冰上融化RNA，室温下(15–25ºC)融化5x miScript RT Buffer 和
RNasefree water 。
先轻弹每个小管使其充分混匀，然后短暂离心以收集管壁和管盖上的液体，最后放置在冰上。
2、在冰上配制reverse-transcription master mix。
配好后混合并放置在冰上。如果miScript Reverse Transcriptase Mix是从-20°C 冰箱拿出来的话，那么在使用完毕后立刻放入冰箱。
如果要配制多次反应，先在一个大管中准备Mix，并且多配制10%。
3、将miScript Reverse Transcriptase Mix分装到每个小管中，然后
加入RNA。
4、在37°C下孵育60分钟
5、在95°C下孵育5分钟以灭活miScript Reverse Transcriptase
Mix
6、如果马上进行PCR，讲产物放置在冰上；如果不立刻做PCR，那么
将反转录产物放置在-20°C
实验步骤：Real-Time PCR检测miRNA或Noncoding RNA
1、融化2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix，10x miScript
Universal Primer, 10x miScript Primer Assay, template cDNA, 和RNase-free water。用前分别混匀各试剂。
2、按下表准备反应mix。
因为PCR反应是热启动反应，所以在配制mix时不须放置在冰上。cDNA的添加量不要超过PCR反应体系的10%。
3、加入模板cDNA到每个小管中
如果同时检测miRNA和miRNA前体，miRNA的cDNA加入量就要和检测前体时的加入量相同（10-20ng）。
4、充分混合好反应mix然后分装到有cDNA的小管中。
5、短暂离心
6、按一下程序进行PCR反应
在每次PCR反应中都要实施融解曲线，以确定反应的特异性和一致性。
miRNA-specific PCR 产物的Tm值大概为74–77°C。
合成的单链miRNA可以用来作为内部的阳性对照。和miRNA同时进行融解曲线分析。
也可以进行cDNA合成后再进行标准曲线构建以确定miRNA的拷贝数。
实验步骤：Real-Time PCR for Detection of Precursor miRNA RNA纯化步骤必须包含基因组DNA去除步骤。并且要求有“no RT”control。
1、融化2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix,10x miScript
Precursor Assay, template cDNA, 和RNase-free water。并分别混匀。
2、按下表配制反应mix。
c DNA的加入量不要超过反转录反应体系的10%。
random翻译
3、分装模板cDNA（10-20ng/reaction）到每个小管中。
4、充分混匀反应mix后分装到每个小管。
5、短暂离心
6、按下列程序进行PCR反应
基因组DNA（1ng/reaction）可以用作阳性对照。讲基因组DNA和miRNA前体同时扩增，并比较融解曲线可以确定融解曲线的重复性。
附录：Protocol for Use of Synthetic miRNA as Positive Control in miRNA Detection
1、按下表准备一个20μl体积的反转录反应，使用5μl的合成miRNA
（终浓度1010copies/μl）和50ng细菌载体RNA。

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