环境昆虫学报2021, 43 (2)： 397 -405Jooroat  f  Egvironvental  Entomology
http ： 〃hjkcxb. alljournalst  net
dol ： 10. 3969^. imi. 1674 -0858. 2021.02. 14
刘苏，蒋秀云，陈诚，汪正威，蒋兴川-大蜡螟成虫3个醛氧化酶基因的鉴定、序列特征与组织表达模式[J ]-环境昆虫学报，2021,
43 (2) : 397 -405-
大蜡螟成虫3
因的鉴定、
特征与 表
刘 苏1*
*，蒋秀云1*，陈 诚2，汪正威3，蒋兴川1**基金项目：国家重点研发计划(2017YFD0200902)；国家自然科学基金(31801806)；安徽省高等学校自然科学研究项目(KJ2017A868)
*共同第一作者简介：刘苏，博士，畐燉授，主要研究方向为昆虫学，E  - mail : w C u L  ahau. edu. cn (蒋秀云，硕士，主要研究方向为农业
昆虫与害虫防治，E  - mail ： ggfgg321@ 126. com
* *通讯作者Author  Or  corresponding ：蒋兴川，博士，副教授，主要研究方向为昆虫行为与化学生态,E  - mail ： jxc678L  sinw  cn
收稿日期 Received ： 2020 —03 —06 (接受日期 Accepted ： 2020 -07 -28
(1.作物有害生物综合治理安徽省重点实验室，植物病虫害生物学与绿防控安徽普通高校重点实验室，
安徽农业大学植物保护学院，合肥230036； 2.安徽审计职业学院，合肥230601；
3.中国科学院
森林生态重点实验室化学生态学组，中国科学院西双版纳 物园，昆明650000)
摘要：醛氧化酶(AOXs )在昆虫的嗅觉生理代谢过程中起重要作用。本研究从大蜡螟Gallepy  v e foof m 成虫中鉴 定了 3个AOW 基因，命名为G v VAOX ］、G v VA0X2和GmelOXS o 这3个基因均含有完整的开放阅读框，所编码
的蛋白 具有醛氧化酶的 征，如具有铁硫氧化还原中心、黄 昔酸结 域和 子结合
区域。系统进化分析显示3个G v VAOX s 被聚在不同的进化分支，且G v VAAX s 与鳞翅目AOXs 亲缘关系最近。
G v VAOXI  和 GvVP0X3 位于同一个基因组框架(scaffold69 )上，而 GvfP0X2 位于 scaffold960 G v VAOX ］、 G v VAOX2和G v VAOX3的外显子数量分别为17个、16个和21个。01^^10X2高量表达于成虫触角，且在触角中
的表达量显著高于其它组织，推测＜110X2可能编码一个气味降解酶并参与醛类气味分子的降解。G v VAOXI 和
G v VA0X3的表达没有组织特异性，二者编码的白可 具气
和外源醛类代谢的功能。
关键词：大蜡螟；醛氧化酶； 进 ； ；表达谱
中图分类号：Q968. 1 ； S433
文献标识码：A
文章编号：1674 -0858 (2021) 02 -0397 -09
IdeetiCcation ，sequence  characteristics ，and  tissue  expression  patterrs  of
tiree  aldehyde  oxidase  genes  in  the  adults  of  the  greater  wax  moth  Galleria  mellonella
LIU  Su 1*，JIANG  Xix-Yun 1*，CHEN  Cheng 2，WANG  Zheng-Wei 3，JIANG  Xing-Chuan 1** (1. Anhui  Pmvinca  Keg  Laboratoy  of  Integrated  Pest  Management  on  Cmps ， Keg  Laboratoy  of  Biology  and  Sustainabia  Management  of  Plant  Disexsas  and  Pests  of  Anhui  Highaz  Education  Ins/tutvs ，Collega  of  Plant
Protection ，Anhui  AgCculturai  University ，HefUl  230036，China ； 2. Anhui  Audit  Collega ，H
efei  230601， China ； 3. Chemical  Ecology  Gmup ， CAS  Keg  laboratoy  of  Typical  Forest  Ecology ， Xshuangbanna
TeopicaeBoanicaeGaeden ， ChineseAcademyoeSciences ， Kunming  650000 ， China )
Absiah : In  insects ， aldehyda  oxidasvs  ( AOXs ) play  a  cCticai  mia  in  tha  olfactoy  sensation  and  biotransformation  process. In  this  study ，threv  AOX  genus  wsa  identified  from  tha  adults  of  tha  greataz  wax  moth ， Gallmia  mePoneP a ，and  named  as  GmVAOXl ，GmVAOX2 and  GmVAOX3，respectively. All  of  tha
threv  genus  contained  complela  open  yading  fymas , and  their  cowsponding  coding  proteins  all  have  tha  typical  Oaturas  of  AOX ， including  tha  iron-sulfur  mdax  cstws , Oavin  adenina  dinucleotida  ( FAD  )
-
398环境昆虫学扌&Journal of Environmental Entomology43
bindiny domain and MoCa camctvr-bindiny domain.Phyloyenetlc analysis showed that three GmelAOXs w/v separated inta diPeant clusters,and that W/a GmefOXs were clos/y related tv their L
epidopteran ortholoys.Both V GmefOXl and GmdAOX3were located in the sama yenomlc scxffold(scxffold69), whereas GmdAOX2was in scxffold96.The number V exons in GmefOXl,GmelAOX2and GmelAOX3 w/v17,16and21,aspectW/y.GmefOX2was highly expressed in the antennae of adults,and the teansceiption eeeeeoKthisgenein antennaewassigniicanteyhigheethan thosein otheeti s ues,suggesting that GmelAOX2mightencodean odoeant-degeadingenzymeineoeeed in the aedehyde deg eadation.The eopee s ion oK GmelAOXl and GmelAOX3wasnotti s ue-speciic,impeyingthatpeoteinsencoded bythetwo genesmightbeineoeeed in thedegeadation oKodoeantsaswe e asmetaboeism oKeoogenousaedehydes.
Key W o C s:GellerO pellonelle；aldehyde axidasvs;phylogenetic analysis;yenomlc location；expression pafilas
昆虫的各项生命活动，如寻配偶、定位寄主与产卵场所、躲避天敌等，都依赖于其灵敏的嗅觉系统(骆丹等，2017；盛子耀等，2019)o昆虫的嗅觉过程始于环境中的气味化合物进入触角上的嗅觉感器，这些气味分子与感器中的载体蛋白和受体等互作，最终激活嗅觉神经元，引导昆虫产生行为反应(杜立啸等，2016；刘伟等，2018；张玉等，2019)。当这一过程完成之后，感器中的气味分子会被迅速降解，才能使嗅觉神经元的敏感性恢复，以应对新一轮的气味刺激(Leal，2013)。
与气味降解相关的酶统称为气味降解酶(odorant-deyradiny enzymes，ODEs)，其包括多种代谢酶家族，如醛氧化酶(aldehyde oxidases，AOXs)、酶(caeboiyeesteeases，CaeEs)、
胞素P450(cyWchmmv P450s，CYPs)和谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferasvs，GSTs)等(Younus et at，2014)。醛类是多种鳞翅目昆虫性信息素的主要组分，也是多种植物的主要挥发性成分，因此昆虫触角中的AOXs对于降解感器中的醛类气味分子和维持嗅觉神经元的敏感性具有重要作用(杨从文等，2010；Choe at at，2013；Xu and Liav，2017)。
首个被鉴定的与气味降解相关的AOX来自烟草天蛾MenPuce sexto(Rybczynskl oi eO，1989)。随后的研究证实在家蚕Bombyp mori和多音天蚕Cnthereee polyphemus触角中也存在多个能够降解醛类(如醛benzaedehyde和蚕蛾醛bombykae)的AOXs(Rybczynski et at，1990)o随着分子生物学的，AOXs的从家蚕、甘蓝夜蛾Memestre bmssPoe、脐橙螟Amyelois trensPelle等昆虫中克隆得到(M/lin at eO，2005；Pelletiar e t el.，2007；Choe at el.，2013)。Choe等使用昆虫细胞系表达了脐橙螟CceCOX2，体外实验证明重组的AwaA0X2蛋白能降解包括绿叶气味反Q-己烯醛(Wans-2-hexenai)和性信息素11Z，13Z-十六碳二烯醛(Z11Z13-16Ald)在内的多种醛类(Choe et eO，2013)'通过对多种昆虫的基因组和转录组数据进行挖掘，大量的AOX基因得以鉴定，其中有很多基因特异性或髙量表达于昆虫触角，表明它们可能会参与醛类气味物质的降解(杨瑜等，2010；Zhany at at，2014；Huany et eO，2016；Xu and Liav，2017；Zhany et at，2017)。此外，还有一些AOXs主要表达于昆虫的非嗅
觉组织或幼虫期。如致倦库蚊CuAx quiequd'esciaies的一个AOX主要表达于髙龄幼虫，并与杀虫剂抗性有关(Coleman at et，2002)；家蚕丝腺中的一个AOX具有催化卩引嗥Q-乙醛(indoiv-3-acetaldehyde)生成卩引嗥Q-乙酸(indoiv-O-acetic acid)的功能(Takei e al.，2019)。
大蜡螟Gelfria mePonello属鳞翅目Lepidoptera 螟蛾科Pyralidav蜡螟亚科Gallefinav，是危害养蜂业的重要害虫之一(杨爽等，2016)o大蜡螟成虫在蜂巢中产卵，孵化的幼虫蛀食巢脾，为害严重时，整箱巢脾被毁，导致蜂飞逃(Kwadha et eO，2017)。目前已被鉴定出的大蜡螟成虫性信息有3种，醛(nonanae)、十一醛(undeexnai)和5，11-二甲基二十五烷(5，11-dimethyepentacosane)(Leyeeeand Moneoe，1973；Seen s on e al.，2014)。大蜡螟成虫对其中的醛和十一醛均有显著的触角电位反应(Payne and FPn，1977)，因此基于醛类挥发物的性信息素通讯对于大蜡螟至关重要。基于此，可预测其触角中应当存在能降解醛类物质的AOXs。本研究通过
2刘苏等：大蜡螟成虫3个醛氧化酶基因的鉴定、序列特征与组织表达模式399
检索大蜡螟触角转录组，在鉴定了3个AOXs编码基因(GmelAOXl、GmelAOX2和GmelPOX3)的基础上，分析了这些基因的序列特征、基因组位置、外显子-内含子结构以及组织表达模式。本研究结果以期为阐明大蜡螟AOXs的生理功能奠定基础。
1材料与方法
1.1实验试虫
大蜡螟幼虫采集自安徽省合肥市郊区养蜂场(蜜蜂品种为意大利蜜蜂Apis tnePpeo)o将幼虫带回实验室，在人工气候箱中饲养并建立实验室种。所用大蜡螟人工饲料的配方参考黄诚华等(2010)。饲养条件为：温度27±1f，相对湿度65%±5%，光：暗周期14h：10h。
1.2同源检索与序列分析
基于Zhav等报道的大蜡螟触角转录组(Zhav et at.,2019)，本研究使用BioEdil软件中的TBLASTN程序在此转录组数据库中检索AOXs编码基因。所用的查询模板为从GenBank中下载的鳞翅目昆虫(如家蚕、棉铃虫Helhoveoa aonigero、大螟Sesamia pfenns等)的AOXs蛋白序列，期望值(E-valuv)设为10-5。输出结果经BLASTX比对和手工检查剔除冗余序列。
获得大蜡螟GmelAOXs基因序列后，使用ORF bi.icgoeec go/,htoi)查其开放阅读框(open reading frama，ORF)；使用ExPASy工具(pasy. oegctooescpeotpaeam2htme)白的理子量与等电点；使用NCBI的CD bO nlm.nih.gav/stactura/cdd/cdd.shtoi)预测蛋白的保守功能域；根据已报道的大蜡螟基因组序列(Lange e al，2018)，使用Speign(www ncbinem nih goicsutiescspeign cspeign cgi)
AOXs基因在基因组框架(scaffold)上的位置以及外显子-内含子结构。使用Clustai Omega服务器(www.ebO ae.uk/tools/msa/clustaiv)进行多序列连配，使用MEGA7.0软件以neighbar/oining法构建系统发育树(Kumar n oi，2016)，各分支置信度经Bootstrap法重复检验1000次。
1.3总RNA提取与cDNA合成
收集羽化后48h之内未交配的大蜡螟雌、雄成虫，解剖为不同组织：触角、去除触角的头部、腹部和足。使用RNAisa Plus试剂(宝生物，大连)提取总RNA，经琼脂糖凝胶电泳和NanoDap2000微量分光光度计分析样品的质量和度，使用ReieeTeaAceqPCR RT MasteeMii with gDNA Removar反转录试剂盒(东洋纺，日本)合成第一链cDNA。
1.4组织表达模式分析
使用实时荧光定量PCR分析GmelAOXs在大蜡螟成虫不同组织中的相对表达水平。所用引物见表1'在前期研究中发现甘油醛A-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因在大蜡螟不同组织中的表达水平较稳定，因此本实验使用该基因作为内参基因。在预实验中，使用琼脂糖凝胶电泳分析每对引物的扩增产物，并将产物送生物公司测序，以确定引物特异性。
定量PCR反应体系20*L，包括10*L SYBR G7een ReaetimePCR Maste7Mii(东洋，)、0.5*L上游引物
、0.5*L下游引物、1*L (10ng)第一链cDNA和8*L ddHO。仪器为美国Bio-Rad公司CFX96型定量PCR仪，反应程序为95f2mW，1个循环；95f10s，60f25s，40个循环。反应完成后，温度从60f逐步升至95f，绘制熔解曲线，以检测是否存在引物二聚体。实验设3次生物学重复，基因相对表达量使用2-AA Ct方法计算(LOak and Schmittgen，2001)。使用DPS9.5进(Tangand Zhang，2013)，不同样本之间的差异显著性经由单方(one-wayANOVA)和Tukey验进行比较。显著性水平设为P<0.05。
2结果与分析
2.1GmelAOXs与分
索大蜡螟角，获得3个
码AOXs的cDNA序列，分别命名为GmePOX］、GmelAOX2和GmelAOX3(GenBank登录号分别为MT039791、MT039792和MT039793)。3个GmelAOXs 的开放阅读框介于3798~3870bp之间，编码的蛋白质长度介于1265~1289个氨基酸之间(表2)o根据cDNA推导的3个GmelAOXs蛋白的分子量较为相似(139.5-144.2kDa)，且等电点分别为6.1、6.0和6.4，均属于酸性蛋白(表2)o BLASTX比对结果表明，3个GmelAOXs与同属螟蛾科的亚洲玉米螟OstOnia furaacalU和脐橙螟
400环境昆虫学扌&Journal p Eaviroomeotal Entopology43
的AOXs的氨基酸一致性最高（一致性67%-72%；表2）。但3个GmelAOXs之间的氨基酸一致性较低，其中GmelAOXl与GmelAOX2的氨基酸一致性为46%,GmelAOXl与GmelAOX3的氨基酸一致性为52%,GmePOX2与GmelAOX3的氨基酸一致性为45%。多序列比对结果表明，3个GmePOXs蛋白序列中均含有相似的结构域：2个铁硫氧化还原中心（2Fe-2S）、8个保守的半胱氨酸残基，1个黄素腺瞟吟二核1酸（FAD）结合区域和1个钳辅因子（MoCa cofactar）结合区域（图1）'
表1本实验所用引物
Table1Primers usee in this sthdy
引物名称引物引物用途Pimer name Prioer sequence(5r-3r)Purpose
GmelAOXl qF TAGCGGTGGCCATAGTTCAC
GmelAOXl qR CCACTGTACACGGCACATCT
GmelAOX2qF CATGTACCTCTGGCCTTGGA实时定量PCR GmelAOX2qR ATGCCCATTTCTCCAACAGT Real-Zoe quanio/ve PCR GmelAOXc qF CAAGCGAGCTACATGACCTCA
GmelAOXc qR TCCTCTAACAAGTCGACTCGT
GAPDH qF GTCATTCCCGCACTTAATGG
内参
GAPDH qR CAGCTTCCTTGACCTTCTGC InOrnai reference
表23个GmelAOX s的序列信息与BLASTX最佳匹配
Table2Sequence information and BLASTX bes hC of three GmelAOX s
BLASTX最佳匹配BLASTX best hit
基因名称
G:n: Name 阅读框长度
ORF
（aa）
分子量
MW
(kDa)
等电点
pl
物种/基因
Species/Gene
GenBank登录号
G:nBank
Acc:s ion numb:e
期望值
E-Calue
一致性
(%)
Identity
GmelAOXl1289144.2  6.1亚洲玉米螟Ostriaia furoacalis AOX2BAR64767072 GmelAOX21271141.6  6.0脐橙螟Amyelois aansitePa AOX2AGQ43599067 GmelAOXc1265139.5  6.4亚洲玉米螟Ostaoia furoacalis AOX6BAR64771067
2.2系统进化分析
基于鳞翅目、双翅目、鞘翅目昆虫和脊椎动物的AOXs蛋白序列构建系统进化树（图2）o因AOXs与黄瞟吟脱氢酶（xxnthinv dehydayenasvs, XDHs）具有较为相似的结构域（Kuasaki et at., 2013），因此使用XDHs作为外。结果清晰地显示，昆虫AOXs与脊椎动物AOXs以及脊椎动物和昆虫的XDHs分别聚类在独立的进化分支（图2）o 大蜡螟GmelAOXs与来自鳞翅目的AOXs亲缘关系较近，GmelAOXl与棉铃虫HaonAOX2、大螟SiyfAOX2）家蚕BmoOOX2和稻纵卷叶螟CmedAOX2聚一，GmelAOX2与螟AtoAOX2聚为一支，GmelAOX3与棉铃虫HarmAOX4和苹果蠹蛾CpomAOX1聚为一支。此外，3个GmePOXs被分隔在不同的进化分支上，暗示它们可能具有功能上的分化（图2）。
2.3基因结构分析
使用Splyn程序分析了GmelAOXs在大蜡螟基因组上的位置、长度和外显子-内含子结构。结果显示，3个GmelAOXs位于不同的基因组框架（scaffold）上，其中GmelAOXl和GmelAOX3位于scaffold69，转录方向均为反向，序列间的距离为602kb；而GmnAOX2位于scaffold96，转录方向为正向（图3-A）。GmelAOXl）GmelAOX2和GmelAOX3
2刘苏等：大蜡螟成虫3个醛氧化酶基因的鉴定、序列特征与组织表达模式401
GmelAOXl GmelAOX2 GmelAOX3RRYEVDG-KYGPDVS K-KCSVDVRTPRDMT EHYSLSGSDVSPRTS
GmelAOXl GmelAOX2 GmelAOX3
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图1大蜡螟3个GmdAOXs蛋白序列比对
Fp.1Alignment of the protein sequences of three GmdAOXs fam Gelfria meOoneP e
注：2个铁硫氧中心([2FeQS]I和II)以横线表示，保守的半胱氨酸残基以实心三角形标注。黄素腺瞟吟二核昔酸(FAD)结合区域和钳辅因子(MoCo cofactor)结合区域分别以虚线和点线表示。Note：Two iron-sulfur redoo centers([2Fe-2S&I and II)arc indicated by the grey line,and consemed cysteine residues arc indicated with solid triangles.The FAD-binding domain and the MoCo cofactor/substrate-binding domain arc indicated by dashed and dvted lmes,respectively.
在基因组上的长度分别为15792bp、22970bp和27 237bp。GmelAOXl和GmelAOX2分别含有17和16个子，而GmefOX2的外显子较多，为21个（图3-B）。
2.4组织表分析
定量PCR结果表明，3个GmefOXs基因在大蜡螟成虫各组织中的表达模式不同。GmefOXl主要表达于雌雄成虫触角和腹部，其在头部和足部中的表达著（P<0.05；4-A）。GmelAOX2要表达雌雄成虫角，其在角中
的表达水平显著高于其织（P<0.05；4-B）。此，GmefOX2
在雌雄触角中的表达差异不

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