⼀、⼆、三、四代测序技术原理详解
测序技术是基因组学的核⼼技术,上期的推送【LAI:基因组组装质量评估新标准】简单介绍了测序技术的发展进程。其实,测序技术的发展主要
“⽣命是序列的”和“⽣命是数据的”。序列是基因组学最基本最重要的数据,也是⽣命科学领域基于两个⾮常具有⾥程碑意义的理念:“⽣命是序列的”和“⽣命是数据的”。序列是基因组学最基本最重要的数据,也是⽣命科学领域⼤数据时代的核⼼组成部分。简单来说,测序技术就是将DNA/RNA分⼦中碱基ATGC的排列顺序显⽰出来。
1953年,Watson和Crick提出DNA双螺旋结构。
DNA双螺旋模型以及“⽣命是序列的”观点的发表,直接推动了测序技术的发展,因为解读⽣命遗传信息的前提就是得到它的载体——序列。
group by的用法及原理详解
从20世纪70年代到现在有很多测序技术和平台的产⽣,其中包括SBC法、454、Ion Torrent、SBL法、Sanger法、Illumina、Pacbio、Nanopore等。今天主要跟⼤家分享后四种常⽤的测序技术。
第⼀代测序技术
Sanger法是基于DNA合成反应的测序技术,⼜称为SBS法、末端终⽌法。1975年由Sanger提出,并于1977发表第⼀个完整的⽣物体基因组序列。
双脱氧核苷酸(ddNTP)的3’位置脱氧,其在DNA的合成过程中不能形成磷酸⼆酯键,因此可以⽤来中断DNA合成反核⼼原理:由于
核⼼原理:由于双脱氧核苷酸(ddNTP)的3’位置脱氧,其在DNA的合成过程中不能形成磷酸⼆酯键,因此可以⽤来中断DNA合成反应,在4个DNA合成反应体系中分别加⼊⼀定⽐例带有放射性同位素标记的ddNTP(分为:ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP),通过凝胶电泳和放射⾃显影,根据电泳带的位置确定待测分⼦的DNA序列。
在每个反应体系中,ddNTP相对于dNTP是很少的,所以只有部分新链在不同的位置特异性终⽌,最终就会得到⼀系列长度不⼀的序列。
第⼆代测序技术
以Illumina平台为代表的第⼆代测序技术实现了⾼通量测序,有了⾰命性进展,使得⼤规模并⾏测序成为现实,极⼤推动了⽣命科学领域基因组学的发展。Illumina循环SBS法(cycle SBS)即SBRT(Sequencing By Reversible Termination,可逆终⽌)的核⼼技术是DNA合成的可逆性末端循环,即3'-OH可逆性的修饰和去修饰。
RTG(Reversible Terminating Group,可逆末端基团)进⾏修饰;将4种碱基分别与不同的荧
荧基本原理:将dNTP的3'-OH以叠氮集团RTG(Reversible Terminating Group,可逆末端基团)进⾏修饰;将4种碱基分别与不同的
基本原理:将dNTP的3'-OH以叠氮集团
光分⼦连接;DNA合成时,RTG能起到类似于ddNTP的作⽤终⽌反应;每次合成反应终⽌并读取信号之后,洗脱RTG和荧光分⼦,进⾏下⼀轮循环。
主要过程:
a, DNA待测⽂库构建
利⽤超声波把待测的DNA样本打断成⼩⽚段,并在这些⼩⽚段的两端添加上不同的接头,构建出单链DNA⽂库。这些⽂库中的DNA在通过flowcell(吸附流动DNA⽚段的槽道)时会随机附着在flowcell表⾯的channel上。每个Flowcell有8个channel,每个channel的表⾯都附有很多接头,这些接头能和建库过程中加在DNA⽚段两端的接头相互配对,并能⽀持DNA在其表⾯进⾏桥式PCR的扩增。
b,c 桥式PCR以Flowcell表⾯所固定的接头为模板,进⾏桥形扩增。经过不断的扩增和变性循环,最终每个DNA⽚段都将在各⾃的位置桥式PCR以Flowcell表⾯所固定的接头为模板,进⾏桥形扩增。经过不断的扩增和变性循环,最终每个DNA⽚段都将在各⾃的位置上集中成束,每⼀个束都含有单个DNA模板的很多份拷贝,进⾏这⼀过程的⽬的在于实现将碱基信号强度放⼤,以达到测序所需的信号要求。
测序⽅法采⽤边合成边测序的⽅法:
1. dNTP模型
2. dNTP加上可终⽌反应的基团RTG和荧光信号
3. 反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4种dNTP
4. 脱掉-OH和⼆磷酸,进⾏合成
5. 反应因RTG终⽌,激发荧光进⾏信号采集。
6. 洗脱RTG和荧光分⼦,进⾏下⼀轮循环
第三代测序技术
以Pacbio平台为代表的SMRT(Single-Molecule Real Time Sequencing,单分⼦实时测序)测序技术具有⾼通量、长读长的特点。
基本原理:Pacbio仍然采⽤边合成边测序的原理,但实现了两个重要的技术突破。⼀个是将荧光分⼦标记在磷酸上,这样在反应停⽌且捕获荧光信号以后,可直接随磷酸基团脱落,解决了因噪⾳污染导致的读长很短的问题;⼆是由于不需要PCR扩增,信号的有效提取成为了关键。通过引⼊零模波导孔(ZMW)技术解决这⼀问题。在纳⽶室底部有⼀个孔径70nm的⼩孔,由于远远⼩于激光的波长,所以激光从底部照射时,只会照亮⼀个⼩的区域,提⾼了信噪⽐。
主要过程:如下图所⽰,类似于Illumina部分展⽰的模式图,也是边合成边测序。

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