Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答)
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:
一、原理
二、分类
i.放射自显影
ii.底物化学发光ECL
iii.底物荧光ECF
iv.底物DAB呈
三、主要试剂
四、主要步骤
五、实验常见的问题指南
1.参考书推荐
2.针对样品的常见问题
3.抗体
4.滤纸、胶和膜的问题
5.Marker的相关疑问
6.染的选择
7.参照的疑问
8.缓冲液配方的常见问题
9.条件的摸索
10.方法的介绍
11.结果分析
一、原理
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂
1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制
含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过
7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重
新配制。如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀
释到100ml终体积。过滤后40C保存。
4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L
HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris 碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。
5、TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰
胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的
自由基。去离子水配制数ml，临用前配制.
6、  SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，
巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得
0.25mol/L Tris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。
8、转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS，并加
入200ml甲醇，加水至总量1L。
9、丽春红染液储存液：丽春红S 2g 三30g 磺基水杨酸30g 加水至100ml 用时上
述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。
10、脱脂奶粉5%(w/v)。
11、NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
12、Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。
13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。
14、过氧化物酶标记的第二抗体。
15、NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。
16、BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。
17、100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。
18、100mmol/L NaCl。
19、50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。
（可以参看分子克隆）
四、主要步骤
仅供实验参考，可以根据自己实验的实际情况进行调整：
实验器材
1.实验器具：单道移液（2-5ml，100-1000μl，20-200μl，5-50μl，0.1-
2.5μl）摇床暗盒杂
交盒50ml 试管2ml EP管冰盒
2.1×PBST 1升10×PBS+9升水+10ml吐温
3.牛奶光明脱脂奶粉25g+500ml的1×PBST
4.丽春红染液膜
实验步骤
1、操作
1.1 膜的活化在膜上标记好线（如裂解液要剪的线，裂解液、IP的道）。
1.2 用镊子夹住膜的边缘，放到铁盒里，膜面朝上。倒上PBST溶液，水平放在摇床上摇5min。
1.3 关闭摇床，倒尽PBST，注意不要将膜倒出来。加入10ml的无水甲醇溶液。调整转速，
摇1min。
1.4 关闭摇床，倒出甲醇溶液，加入1/3的PBST，摇床摇5min，重复2次。
2、封闭
2.1 完成膜的活化和清洗后，关闭摇床，倾斜倒出PBST溶液，不要将膜倒出来。
2.2 加入20ml的牛奶（牛奶使用前摇一下混匀防止沉淀），要保证膜完全在牛奶里。水平
放到摇床上摇1h，调节转速为80rpm。
3、一抗稀释
3.1 取出样品置于冰盒上，稀释时样品贴壁加到牛奶中，一定保证样品加到牛奶中。
3.2 杂交盒子每张膜10ml稀释完混匀后倒入盒子里
4、二抗
4.1 稀释二抗，每张膜10ml。混匀，摇床上摇30min。
5、洗膜用PBST洗膜，3次，每次10min。
6、显Sloution A (1ml) + Sloution B(25μl)混匀，每张膜1ml。
6.1 将PVDF膜平整的铺于带有荧光标签的塑料垫板上，保持带有蓝marker的一面朝上。
6.2 在EP管中按照显液的配制比例配好显液，盖上EP管盖，颠倒管子使显液混匀。
6.3 使用200-1000μl的移液吸取1ml的显液均匀的滴到PVDF膜上。用镊子将膜翻转过
来，使带marker蓝条带的一面与显液均匀接触。
6.4 计时5min后，将膜翻转，保持带有marker的一面朝上，使用滤纸吸去显液。
6.5 迅速撕取一张保鲜膜平铺于垫板上。保持膜与保鲜膜之间无皱褶。
7、曝光
7.1 将包好的膜放在暗盒里，打开荧光灯，调节灯光的强弱，以膜上的亮度来确定曝光的时
间。通常曝5min，压上4张胶片。
7.2 5min后，取出胶片，一张一张的放到显影液中，显影一分钟（这时可更据显影的结果看
是否重新压片，如曝的深的可减少曝光时间，浅的可延长曝光时间）
7.3 显影后，取出胶片放自来水下冲洗一遍，放到定影液中定影。要等到定影完全后才能取
出胶片，否则容易见光导致胶片报废。
五、实验常见的问题指南
根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！）：
1. 参考书推荐
A. 对初学者看什么资料比较好？
group by的用法及原理详解解答：《抗体技术实验指南》和Antibodies（a laboratory manual，wrote by Ed Harlow ，david
lane）两本书不错。
2. 针对样品的常见问题
B. 做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot （以下简写成Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查Western Blot过程，提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。
E. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？
解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。
F. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？
解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
G. 我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜变淡了，有什么办法可以解决？
解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加5－10％甲醇。
H. 想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗？
解答：260kd的蛋白不好做，分离胶用6％，Stacking Gel 3.5％。
I. 如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。
解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的comb。
J. 蛋白变性后可以存放多久？
解答：－80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。
K. 我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？
解答：上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为105ＫＤ的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。
L. 接下来我准备采用DAB显技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？
解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点．
M. 还有一问题，一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？
解答：Western Blot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。
N. 做组织样品的western的时候，处理样品有什么诀窍吗？还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？浓度如何？效果是不是比BSA好一点？
解答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ和蛋白酶抑制剂cocktail），封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗体，使用ＢＳＡ也是不错的选择。
O. 您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？
解答：做200kd蛋白的Western Blot时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。
P. 有什么方法可以提高上样量？
解答：可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量。
Q. 我要检测的目的蛋白是分子量大概为42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机，有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大？
解答：如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做Western Blot就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。42kd 不算大，也不算小，所以，可以按照一般的转移方法实施。
R. 蛋白的上样量有没有什么具体的要求？
解答：上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了，但是不要超过0.3μg/mm2。
S. 一抗，二抗的比例是否重要？
解答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。
3. 抗体

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