实验研究
CHINESE COMMUNITY DOCTORS 异黏蛋白(MTDH)又称星型胶质细胞上调基因-1(AEG-1)，在多种肿瘤中高表达，如乳腺癌、肝癌、结直肠癌等[1-3]。研究表明，MTDH 可通过PI3K/AKT、NF-κB 及Wnt/β-catenin 等信号通路，调控肿瘤的发生发展，其高表达与肿瘤转移、耐药、血管生成、预后差相关。然而MTDH 在胶质瘤发生发展中的作用尚不清楚。本研究通过小RNA 干扰技术(siRNA)沉默内源性MTDH，下调MTDH 的表达，研究下调MTDH 对胶质瘤细胞U87增殖、迁移和侵袭的影响，探讨MTDH
在胶质瘤中生物学功能，对将MTDH 发展成一个胶质瘤的新靶标，改善胶质瘤的预后具有重要意义。资料与方法实验材料：MTDH siRNA及qRT-PCR 检测试剂盒，转染试剂脂质体2000。细胞培养：胶质瘤细胞株U87购置上海细胞研究所，在5%CO 2、37℃条件下，培养于含10%小牛血清的RPMI1640中。细胞转染：分为处理组(MTDH siRNA)与对照组(si-NC)，接种细胞于96孔板完全培养基中，细胞生长至30%～50%密度；无菌EP 管配好转染试剂及siRNA 于无血清培养液，室温放5min，按操作程序转染细胞，置于37℃、5%CO 2培养箱中，6h 后换液，加入完全培养基继续培养48h，收集细胞。qRT-PCR 检测MTDH 表达水平：qRT-PCR 反应：反应体系20μL，包括5μmol/L MTDH 特异PCR 引物0.4μL、稀释后的RT 产物2μL、5U/μL 耐热DNA 聚合酶0.2μL、2×qRT-PCR 缓冲液10μL、灭菌双蒸水7.4μL。反应条件：95℃3min 活化Tag 酶，然后95℃12s、62℃35s，共40个循环。
MTT 法检测细胞增殖活性：MTDH 处理U87细胞24h，0.25%胰酶消化，吹打成单细胞悬液离心。用含10%小牛血清RPMI-1640培养基稀释成5×104个/mL 细胞悬液，取200μL 接种于96孔板中，设复孔5个。置于37℃、5%CO 2培养箱48h。每孔加灭菌MTT 液(5mg/mL)
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2018.25.001
基金项目湖南省自然科学基金(2018JJ2353)
摘要目的：探讨下调异黏蛋白(MTDH)的表达对胶质瘤细胞U87增殖、迁移和侵袭的影响。方法：使用
脂质体将
MTDH 干扰小RNA(MTDH siRNA)转染U87细胞(处理组)，同时用si-NC 转染U87细胞作为阴性对照(对照组)。利用
qRT-PCR 验证转染后U87细胞的MTDH 表达水平。通过MTT 法、细胞划痕、transwell 侵袭实验观察下调MTDH 的
表达对U87细胞增殖、迁移和侵袭的影响。结果：处理组细胞的MTDH 表达量明显下调，表明转染MTDH siRNA 能
有效下调U87细胞的MTDH 表达。MTT 实验表明，与对照组细胞相比，处理组的细胞增殖速度明显下降。细胞划痕
实验显示下调MTDH 的表达抑制了细胞的迁移能力。Transwell 侵袭实验显示，处理组的细胞侵袭能力较对照组细胞
明显下降。结论：下调MTDH 的表达能抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力，MTDH 可成为胶质瘤的潜在
靶点。
关键词胶质瘤；MTDH；细胞增殖；细胞侵袭
Down regulation of MTDH expression to inhibit proliferation,migration and invasion of glioma U87cells
Zhang Jincan,Liao Yongshi(Corresponding author)
Department of Neurosurgery,the Second Hospital Affiliated to Nanhua University,Hengyang,Hunan 421000
Fund project Hunan natural science foundation(2018JJ2353)
Abstract Objective:To explore the influence of down regulation of MTDH expression for proliferation,migration and invasion of
glioma U87cells.Methods:MTDH small interfering RNA(MTDH siRNA)was transfected into U87cells(the treated group)by
liposome,and U87cells were transfected with si-NC as the negative control(the control group).QRT-PCR was used to verify the
MTDH expression level of U87cells after transfection.We observed the influence of down regulation of MTDH expression for
proliferation,migration and invasion of glioma U87cells by MTT assay,cell scratch test and transwell invasion test.Results:In the
the treated group,the expression of MTDH in the cells was obviously down-regulated,it indicated that transfection of MTDH
siRNA could effectively down regulate the MTDH expression of U87cells.Compared with the control group,MTT assay showed
proliferationthat the cell proliferation rate of the treated group decreased significantly.Cell scratch test showed that down-regulation of MTDH
inhibited cell migration.Transwell invasion test showed that the invasive ability of the treated group was significantly lower than
that of the control group.Conclusion:Down regulating the expression of MTDH can inhibit the proliferation,migration and invasion
of glioma cells,MTDH can be a potential target for the treatment of glioma.
Key words Glioma;MTDH;Cell proliferation;Cell invasion
下调MTDH 表达抑制胶质瘤U87细胞增殖、迁移与侵袭
张金灿廖勇仕(通讯作者)
421000南华大学附属第二医院神经外科
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CHINESE COMMUNITY DOCTORS 实验研究中国社区医师2018年第34卷第25期20μL。选择570nm 波长，酶标仪检测各孔吸光值并记录。实验重复3次。细胞划痕和transwell 侵袭实验检测细胞迁移和侵袭能力：MTDH 转染U87细胞48h 后，消化细胞，用无血清培基洗涤2次，按操作进行。统计学处理：采用SPSS 19.0分析数据，计量资料用(x ±s )表示，采用t 检验；计数资料用(%)表示，采用χ2检验。P ＜0.05差异有统计学意义。结果下调MTDH 后U87细胞增殖速度下降：与对照组细胞(1.00±0.06)相比，转染MTDH siRNA后处理组细胞MTDH的表达量(0.28±0.01)明显下调，差异有统计学意义(P ＜0.05)，表明MTDH siRNA能有效下调U87细胞的MTDH表达。然后，我们通过MTT法检测下调MTDH对U87细胞增殖的影响。结果显示，转染MTDH 48h 后，与对照组细胞(0.564±0.01)相比，
处理组细胞的增殖速度(0.234±0.02)明显减慢，差异有统计学意义(P ＜0.05)。下调MTDH 后U87细胞迁移能力下降：与对照组细胞(0.57±0.02)相比，细胞划痕48h 后处理组细胞划痕愈合率(0.25±0.03)明显降低，差异有统计学意义(P ＜0.05)。提示下调MTDH 表达能够在一定程度上抑制U87细胞迁移。下调MTDH 后U87细胞侵袭能力下降：我们将细胞接种于Transwells 小室，置于24孔板，48h 后取出Transwells 小室固定，结晶紫染，显微镜下计数5个视野穿出的细胞数。统计分析发现，与对照组细胞(253.2±12.30)相比，处理组细胞的侵袭能力(108.6±9.29)明显降低，差异有统计学意义(P ＜0.05)。提示下调MTDH 表达明显抑制U87细胞的侵袭能力。讨论胶质瘤是目前临床中较为常见的一种中枢神经系统肿瘤，其临床效果差，容易复发，对患者的健康和生活产生严重的影响。在目前的医疗技术手段下，针对胶质瘤患者，主要采用手术，然后结合放疗和化疗进行，但效果欠佳，并且无论手术还是放化疗，均会对患者的身体产生较大的损害，给患者身体和精神上造成严重的打击，严重降低患者的生活质量，也给患者家庭和社会带来沉重的经济负担。随着对胶质瘤发生和发展过程研究的深入，其具体的发病机制方面已取得了重大的突破，但针对其，尚没有研究出更好的手段，其效果和预后无较大的改善，尤其在一些恶性程度较高的
胶质瘤患者中，预后极差[4]。目前基因诊断和基因是研究的热点，许多学者在该领域开展了大量的研究，目前研究的主要思路是寻一个明确的作用靶点，然后通过作用于该靶点来阻断基因的表达，从而影响到其后的信号通路，抑制肿瘤细胞的增殖，并促进其逐渐凋亡。目前临床中已发现多个
作用靶点，而其中最为重要的一个就是MTDH，其已被证实在多种肿瘤中表达升高，与肿瘤的发生发展、侵袭、转移及耐药相关，是肿瘤诊断、及预后评价的一个重要靶点。研究发现，干扰MTDH 表达可抑制食管癌细胞增殖，使细胞周期阻滞在S 期[5]。下调MTDH 基因表达，还可以抑制乳腺癌细胞上皮间质转化，降低其侵袭和迁移能力[6]。表明MTDH 抑制剂不仅可以抑制肿瘤生长，而且还能降低肿瘤转移的风险，具有成为肿瘤新疗法的前景。但MTDH 在胶质瘤发生发展中的作用尚需进一步研究。有研究者报道miR-22可通过靶向抑制MTDH 的表达从而抑制胶质瘤细胞的增殖[7]。本研究通过在胶质瘤细胞U87中
转染MTDH siRNA，观察下调MTDH 表达对U87细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。MTT 试验结果表明下调MTDH 能明显抑制胶质瘤细胞的增殖能力。我们
的试验结果表明下调MTDH 能抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力，MTDH 可能成为胶质瘤的潜在靶点。
但MTDH 的功能特性及潜能还
有待进一步研究确认。在将来的研究
中，我们仍会重点倾向于研究MTDH 在
胶质瘤中的功能和机制，使该领域的研究更加深入，并逐步探讨其在胶质瘤中的应用前景，为胶质瘤的防治提供依据。
参考文献
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[J].中南医学科学杂志,2017,45(3):295.[3]张伟，方子乔，吉化春.结肠腺癌组织MTDH 和MMP-9表达临床意义研究[J].中华肿瘤防治杂志,2015,22(10):786-791.[4]李国亮，王选重，田沁森，等.脑胶质瘤综合新进展[J].转化医学电子杂志,2017,4
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[5]杨晨晨，贺家勇，郑树涛.MTDH 靶向RNA 干扰质粒构建及其对食管癌细胞EC9706的影响[J].新疆医科大学学报,2015,5(11):1362.[6]刘兆喆，曹恒，丁震宇.下调MTDH 基因表达对乳腺癌细胞转移潜能影响机制研究[J].中华肿瘤防治杂志,2014,21(8):575-579.[7]李荣国，王剑，杨少陵.miR-22通过靶向MTDH 抑制胶质瘤细胞的生长[J].中国癌
症杂志,2014,2(6):401.
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