星形胶质细胞的体外生长特性
蔡杰;彭会明;周洁萍;孙宗全;刘仁刚
【摘 要】目的 研究纯化培养的星形胶质细胞的体外生长特性,作为进一步研究星形胶质细胞功能的依据.方法 将纯化的星形胶质细胞分为6h 、12h 、18h 、24h 、30h 、36h 、42h 、48h 、54h 、60h 、72h 、84h 、96h 、120h 14个时间组,培养不同的时间后,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线观察细胞的生长状况,用流式细胞学检测细胞周期各时相的变化并绘制增殖指数曲线,所得数据用SPSS软件进行统计学分析.结果 ①星形胶质细胞的生长曲线可明显的分为三个阶段:第一阶段为0至24h,在此时间内生长曲线平缓上升,其斜率为0.64.第二阶段为24h至84h,在此时间内生长曲线急剧上升,其斜率为2.69;此阶段中24h至48h时曲线最陡,斜率为3.94,细胞呈指数生长.第三阶段为84h至120h,在此时间内生长曲线走势平直,其斜率为-0.005.②星形胶质细胞的增殖指数在第一个细胞增殖周期内可以反映细胞的增殖状态,第一个细胞周期结束后,细胞的数量继续上升增殖指数却降低了.结论 培养的星形胶质细胞的生长过程分为潜伏期、指数生长期和停滞期三个阶段,其潜伏期为0至24h,指数生长期为24h至48h,停滞期为84h以后.单纯用增殖指数等类似的指标作为细胞增殖状态的判断标准
是有一定局限性的,一定要将这些指标与细胞数量结合起来分析.%Objective This study is aiming to investigate the growth characteristics of the purified as-trocytes in vitro, which the next study will base on. Methods Purified astrocytes from cerebral cortex of newborn rats were divided into 14 groups. After incubation for different hours(6h ,12h , 18h , 24h , 30h ,36h , 42h , 48h , 54h , 60h ,72h , 84h , 96h , 120h) , we observed the proliferation by cell counting and drew the growth curve of astrocytes, and we observed the cell cycle by the flow cytometer and drew the proliferation index curve of astrocytes The corresponding data were analyzed with SPSS statistical software. Results The growth curve of astrocytes were divided into three phases. The first phase continues from 0 to 24 hours, the slope rate is 0. 64. The second phase continues from 24 to 84 hours, the slope rate is 2. 69. At the first part of the phase (from 24 to 48 hours) the slope rate is 3. 94 and the growth of cells is the fastest in the total process. The cells start the third phase after 84 hours, the slope rate is -0. 005. The proliferation index of astrocytes can reflect the proliferation of astrocytes in the first cell cycle. After the first cell cycle, the proliferation index reduces but the number of the cells is increase. Conclusion The growth process of
purified astrocytes can be divided into 3 phases; latent phase (from 0 to 24 hours) , logarithmic growth phase (from 24 to 48 hours) and stagnate phase (from 84 to 120 hours). By using merely the indexes, such as the proliferation index, it is circumscribed to estimate the proliferation of astrocytes.
【期刊名称】《中国组织化学与细胞化学杂志》
【年(卷),期】2011(020)005
【总页数】5页(P486-490)
【关键词】星形胶质细胞;增殖;细胞周期;生长曲线;增殖曲线
【作 者】蔡杰;彭会明;周洁萍;孙宗全;刘仁刚
【作者单位】华中科技大学同济医学院附属协和医院心外科,武汉,430022;华中科技大学同济医学院基础医学院解剖学系,武汉,430030;华中科技大学同济医学院基础医学院解剖学系,武汉,430030;华中科技大学同济医学院附属协和医院心外科,武汉,430022;华中科技大学同济医学院基础医学院解剖学系,武汉,430030
【正文语种】中 文
【中图分类】R329
星形胶质细胞（Astrocyte，AS）是中枢神经系统内数目最多的一类细胞，它在神经系统发育、突触传递、神经组织修复与再生、神经免疫以及多种神经疾病中的病理机制等方面，都起着十分重要的作用［1-4］。正是因为星形胶质细胞的功能如此之大，所以对于它的研究已经成为近年来研究的热点。要研究其生物学功能，必须了解星形胶质细胞的体外生长特性。本实验对星形胶质细胞进行了培养，通过绘制星形胶质细胞的生长曲线和增殖指数曲线，探讨了体外培养的星形胶质细胞的生长特性。
1.实验动物、主要试剂和主要仪器
2d以内新生 Wistar大鼠，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。DMEM／F12培养基、胎牛血清和马血清（Gibco公司）；多聚L-赖氨酸、胰蛋白酶和EDTA（Sigma公司）；青霉素、链霉素（华北制药厂）；台盼蓝（Sigma公司）；碘化丙啶（propidium iodide，PI，Sigma公司）。Shellab Model 2300型自控式二氧化碳培养箱（美国Sheldon
公司）；OLYMPUS倒置相差显微镜（日本）；FACSCalibur流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）。
2.新生大鼠大脑皮层星形胶质细胞的纯化培养
参照 McCarthy等（1980）方法［5］，并加以改良，进行新生大鼠大脑皮层星形胶质细胞的原代培养。将出生2天以内的新生Wistar大白鼠10只，用75%的酒精浸泡消毒后，采用无菌方法迅速取出大脑，用冷的D-Hanks液清洗并剔除脑膜和血管，取大脑皮质，将组织剪碎为1mm3，用0.125%胰蛋白酶，37oC消化10min，过滤（200目尼龙滤网），离心（1000rpm 5min），去上清，加入DMEM／F12完全培养基制成细胞悬液。计数后按1×106／cm2接种于培养瓶，加入DMEM／F12完全培养基，在37℃，5%CO2培养箱中培养9天（每3天更换培养液一次），第9天将培养瓶置于恒温旋转摇床上37℃，240rpm，摇18h，去掉含有悬浮细胞的培养液，用DHanks液清洗贴壁细胞3次，即得纯化的星形胶质细胞。经免疫细胞化学SABC法检测，98%以上的细胞GFAP免疫反应为阳性。
3.细胞分组培养
将42个消毒过的25cm2培养瓶涂上多聚赖氨酸，然后将纯化的星型胶质细胞以1×105个／cm2的密度分组传代于培养瓶中。纯化的星形胶质细胞被分成14个时间组，每组3瓶。
接种后加入DMEM／F12完全培养基，在37℃，5%CO2环境下培养，在培养54h时换一次培养基。培养的细胞分别在14个时间点（6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h、54h、60h、72h、84h、96h、120h）取材，每时间点均收集3瓶细胞，进行细胞计数和流式细胞仪检测。
4.细胞计数及细胞生长曲线的制作
将收集的每瓶细胞各制成细胞悬液，从每瓶的细胞悬液中随机取出4滴用血计数板进行细胞计数。以细胞数／ml为纵坐标，对应的培养时间为横坐标绘制成图，即为细胞生长曲线。
5.流式细胞仪检测细胞周期
将收集的不同时间点的星形胶质细胞，用预冷的70%乙醇固定、4℃过夜，上机前1h，1000rpm离心10min，去上清，加1ml消毒PBS，混匀，1000rpm离心10分钟，洗两次，加50μg／ml的PI染液0.5 ml和200μg／ml的Rnase酶0.5ml染，在4℃环境中避光30min后，
采用FACSCalibur型流式细胞仪进行细胞周期的检测。
每个样本检测10000个细胞，以细胞指数表示分布于细胞周期各时相的细胞百分比数，以增殖指数反映进入细胞增殖周期的细胞百分比数。
细胞指数＝各周期时相的细胞数／10000×100
增殖指数＝S期细胞指数＋G2／M期细胞指数
6.统计分析
所得数据应用SPSS12.0软件进行处理。以方差分析进行差异性分析，P＜0.05定为差异有显著性，数据以均数±标准差（¯x±s）表示。
1.形态学观察
纯化培养的星形胶质细胞细胞分裂增殖活动旺盛，相差显微镜下形态学特征：胞体较大而扁，形状不规则，星形胶质细胞的胞突尤其是初级胞突较多较长，呈放射状。细胞随着培养时间的延长，星形胶质细胞的密度不断的增大，细胞也不断地从未汇合、半汇合到完全
汇合。星形胶质细胞在传代30h后，接种细胞贴壁、铺展、伸出突起，细胞增殖旺盛。（见图1）星形胶质细胞在传代50h后，细胞增殖旺盛，达到70%左右的汇合，可见细胞的分裂相。（见图2）星形胶质细胞在传代74h后，细胞已完全铺满，达到100%左右的汇合。（见图3）
2.细胞计数结果
纯化的星形胶质细胞在体外培养不同的时间后，细胞计数的结果见表1。细胞生长曲线见图4。
proliferation
从图4中可见星形胶质细胞的生长曲线可明显的分为三个阶段：第一阶段为0至24h，在此时间内生长曲线平缓上升，其斜率为0.64。第二阶段为24h至84h，在此时间内生长曲线急剧上升，其斜率为2.69。第三阶段为84h至120h，在此时间内生长曲线走势平直，其斜率为-0.005。在第二阶段内曲线又可明显的分为三个部分：从24h到48h曲线最陡，斜率为3.94；从48h到72h曲线相对平缓，斜率为1.71；从72h到84h曲线又变得陡峭，斜率为2.17。
随着培养时间的延长，星形胶质细胞的细胞数不断的增加。在24h时细胞数较6h时增加了一倍，30h时细胞数又较24h时增加了一倍，48h时细胞数较30h时再次倍增，之后细胞生长较慢，到84h时细胞数达到顶峰，但并未达到48h时的两倍（见表1）。因此，48h为细胞增生率极限点，24h至48h为细胞指数生长期。

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