lncRNA PVT1对前列腺癌细胞增殖
及侵袭、迁移的影响
张建伟，王华东，郭宝印，李海波，孙凤亮
天津市宝坻区人民医院，天津301800
摘要：目的探讨长链非编码RNA（lncRNA）人浆细胞瘤转化迁移基因1（PVT1）对前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。方法传代培养人前列腺癌细胞DU145、人正常前列腺上皮细胞RWPE-1（以下分别称DU145、RWPE-1细胞），采用RT-qPCR法检测DU145、RWPE-1细胞lncRNA PVT1mRNA表达。将DU145细胞随机分为观察组和对照组，分别转染lncRNA PVT1siRNA和Negative Control siRNA，经G418筛选获得稳转细胞株，采用RT-qPCR法检测lncRNA PVT1mRNA表达，采用Western blotting法检测lncRNA PVT1蛋白表达，采用MTT法检测培养12、24、
36、48、60、72h细胞增殖活性，采用Transwell小室实验检测细胞侵袭能力，采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力。
结果DU145细胞lncRNA PVT1mRNA相对表达量明显高于RWPE-1细胞（t=7.938，P<0.01）。观察组lncRNA PVT1mRNA和蛋白相对表达量均低于对照组（t分别为5.053、18.110，P均<0.01）。观察组培
养60、72h时细胞增殖活性均低于对照组同期（P均<0.01），而两组培养12、24、36、48h时细胞增殖活性比较差异均无统计学意义（P均>
0.05）。观察组穿膜细胞数和细胞迁移率均低于对照组（t分别为6.982、11.782，P均<0.05）。结论前列腺癌细胞
lncRNA PVT1高表达，下调lncRNA PVT1表达可抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移。
关键词：前列腺癌；长链非编码RNA；人浆细胞瘤转化迁移基因1；细胞增殖；细胞侵袭；细胞迁移
doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2021.10.010
中图分类号：R737.25文献标志码：A文章编号：1002-266X（2021）10-0045-04
Effects of lncRNA PVT1on proliferation，invasion，and migration of prostate cancer cells
ZHANG Jianwei，WANG Huadong，GUO Baoyin，LI Haibo，SUN Fengliang
Tianjin Baodi Hospital，Tianjin301800，China
Abstract：Objective To investigate the effects of long non-coding RNA（lncRNA）human plasmacyt
oma variant translocation1（PVT1）on the proliferation，invasion and migration of prostate cancer cells.Methods Human prostate cancer cells DU145and human normal prostate epithelial cells RWPE-1（hereinafter referred to as DU145and RWPE-1 cells，respectively）were subcultured.RT-qPCR was used to detect the expression of lncRNA PVT1mRNA in DU145and RWPE-1cells.The DU145cells were randomly divided into the observation group and control group.They were transfected with lncRNA PVT1siRNA and Negative Control siRNA，respectively.The stable transfected cell line was screened by G418.The expression of lncRNA PVT1mRNA was detected by RT-qPCR，and the expression of lncRNA PVT1protein was detected by Western blotting.The MTT method was used to detect the cell proliferation activity of cells cultured for 12，24，36，48，60，72h，the Transwell chamber test was used to detect the cell invasion ability，and the cell Scratch test was used to detect the cell migration ability.Results The relative expression of lncRNA PVT1mRNA in DU145 cells was significantly higher than that in RWPE-1cells（t=7.938，P<0.01）.The relative expression levels of lncRNA PVT1mRNA and protein in the observation group were lower than those in the control group（t=5.053and18.110，respec⁃tively，both P<0.01）.The cell proliferation activity of the observation group was lower than that of the control group at60 and72hours of culture（both P<0.01），but there was no statistically significant difference in cell proliferation activity between the two groups when the cells were cultured for12，24，36，and48h（
all P>0.05）.The number of transmem⁃brane cells and cell migration rate in the observation group were lower than those in the control group（t=6.982and
11.782，respectively；both P<0.05）.Conclusion The expression of lncRNA PVT1in the prostate cancer cells is high⁃
ly expressed，and down-regulating the expression of lncRNA PVT1can inhibit the proliferation，invasion and migration of prostate cancer cells.
Key words：prostate carcinoma；long non-coding RNA；human plasmacytoma variant translocation1；cell prolifer⁃ation；cell invasion；cell migration
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前列腺癌是男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤之一。随着我国人口老龄化加剧，前列腺癌的发病率不断上升，已成为我国男性第五大常见恶性肿瘤［1］。有研究报道，晚期前列腺癌后易出现复发或转移，这是导致患者生存期较短的主要原因［2］。但目前前列腺癌复发或转移的分子机制尚不完全清楚。近年研究发现，长链非编码RNA（lncRNA）可作为致癌基因或抑癌基因参与人类多种肿瘤的发生、发展［3］。人浆细胞瘤转化迁移基因1（PVT1）是lncRNA 家族成员之一，基因定位于人染体
8q24.21上，可参与染质修饰、蛋白质活性调节等生物学过程，与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移密切相关［4-5］。有研究报道，lncRNA PVT1能够通过多种途径参与肿瘤恶性进展，并与肿瘤术后复发和转移有关［5-6］。但目前
lncRNA PVT1与前列腺癌关系的报道较少。2018年6月—2020年1月，本研究观察了lncRNA PVT1对前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。现报告如下。1材料与方法
1.1材料人前列腺癌细胞DU145、人正常前列腺上皮细胞RWPE-1，购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。lncRNA PVT1敲低质粒（lncRNA PVT1siRNA）、阴性对照质粒（Negative Control siRNA），由湖南丰晖生物科技有限公司设计合成。紫外分光光度计和多功能酶标仪，购自美国赛默飞公司；CFX96Touch实时荧光定量PCR仪，购自美国Bio-Rad公司；AlphaImager HP凝胶成像系统，购自美国ProteinSimple公司。G418，购自美国Amresco公司。PrimeScript Reverse Transcriptase，购自瑞士Roche公司；SYBR GreenⅠ核酸染料，购自北京索莱宝科技有限公司。PVT1、β-actin一抗以及辣根过氧化物酶标记的IgG二抗，购自美国CST公司。
1.2细胞传代培养将DU145细胞接种于RPMI 1640培养基，RWPE-1细胞接种于含5ng/mL人重组表皮生长因子的角质形成细胞无血清培养基，然后置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养，并根据培养基pH变化更换新的培养基。当细胞生长融合80%左右时，用含0.25%EDTA的胰蛋白酶消化处理后，按1∶4传代。
1.3lncRNA PVT1mRNA表达检测采用RT-qPCR 法。取传3代、对数生长期的DU145、RWPE-1细胞各1×107个，采用TRIzol法提取细胞总RNA，经紫外分光光度计鉴定，提取的总RNA纯度和浓度合格，可用于后续实验。按PrimeScript Reverse Tran⁃scriptase说明将总RNA逆转录为cDNA。逆转录条件：40℃40min，30℃10min。以cDNA为模板，按SYBR GreenⅠ说明进行PCR扩增。引物序列：lncRNA PVT1上游引物5'-TAGGGTACGCTGCCG⁃TATGCT-3'，下游引物5'-CCGTACGTAGCCGTAT⁃GAGCT-3'；U6上游引物5'-CCTAAGTCCCGT⁃CAGTCGTGA-3'，下游引物5'-GCTAGCGCCTC⁃CAGCTGTCG-3'。PCR反应体系共25μL：2×Taq PCR MasterMix1
2.5μL，cDNA模板1μL，上下游引物各1μL，ddH2O9.5μL；反应条件：95℃20s，95℃10s、60℃20s共40个循环，最后75℃10s。以U6为内参，采用2－ΔΔCT法计算lncRNA PVT1 mRNA相对表达量。实验重复3次，取平均值。1.4细胞转染与稳转细胞筛选取传3代、对数生长期DU145细胞，以
3.5×105个/孔接种于含RPMI 1640培养基的6孔板，然后置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。培养24h，随机将细胞分为观察组和对照组，按Lipofectamine2000说明，分别转染lncRNA PVT1siRNA和Negative Control siRNA，然后置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱。转染48h，加入适量G418，使其终浓度分别为0、200、400、800、1000mg/L，每3～4天更换1次筛选培养基。培养10～14d，以细胞全部死亡的最低浓度为G418最佳筛选浓度。以G418最佳筛选浓度的一半维持培养转染后的细胞，直至获得稳转细胞株，分别检测lncRNA PVT1mRNA和蛋白表达。lncRNA P
VT1mRNA表达检测采用RT-qPCR 法，检测步骤同1.3。
lncRNA PVT1蛋白表达检测采用Western blotting 法。收集上述稳转细胞，加入适量细胞裂解液充分裂解，提取细胞总蛋白，经BCA法蛋白定量合格。然后加入等体积的上样缓冲液，煮沸变性。取变性蛋白30μg，SDS-PAGE（5%浓缩胶、10%分离胶）分离蛋白。采用湿转法将蛋白电泳产物转印至PVDF 膜上，然后用5%脱脂奶粉封闭1h，分别加入PVT1、β-actin一抗（稀释比均为1∶1000），4℃孵育过夜。次日，吸弃一抗，TBST冲洗，加入辣根过氧化物酶标记的IgG二抗（稀释比为1∶4000），室温孵育1h。ECL发光，在AlphaImager HP凝胶成像系统中自动曝光。以β-actin为内参，以目的蛋白电泳条带灰度值与内参蛋白电泳条带灰度值的比值作为目的蛋白相对表达量。实验重复3次，取平均值。
1.5细胞增殖活性检测采用MTT法。收集上述稳转细胞，用完全培养基重悬制成密度为1×104个/mL 的细胞悬液，取细胞悬液200μL接种于96孔板，然后置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱。分别于培养12、24、36、48、60、72h，每孔加入5mg/mL
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MTT溶液20μL，室温孵育4h；弃上清液，加入DMSO150μL，充分混匀。酶标仪于570nm波长处检测各孔的光密度（OD）值。以OD570值代表细胞增殖活性。每个时间点设6个平行孔。实验重复3次，取平均值。
1.6细胞侵袭能力检测采用Transwell小室实验。收集上述稳转细胞，用无血清的培养基制成密度为
2.5×104个/mL的细胞悬液。取细胞悬液500μL 加入Transwell小室上室，下室加入600μL含10% FBS的RPMI1640培养基。然后将Transwell小室置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养24h。取出Transwell小室，用棉签拭去未穿膜细胞，经多聚甲醇固定和结晶紫染，倒置相差显微镜下拍照观察。随机选取5个200倍不重叠视野，计数穿膜细胞数。以穿膜细胞数表示细胞侵袭能力。实验重复3次，取平均值。
1.7细胞迁移能力检测采用细胞划痕实验。收集上述稳转细胞，用完全培养基重悬，制成密度为2×106个/mL的细胞悬液，取细胞悬液2mL接种于6孔板，然后置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱培养。当细胞生长融合70%左右时，用10μL移液器吸头垂直于孔底划5条平行划痕，PBS冲洗去除悬浮细胞，显微镜下拍照观察并记录划痕距离（即0h划痕距离）。吸弃原培养基，加入含10%FBS的RPMI1640培养基继续培养24h，显微镜下拍照观察并记录划痕距离（即24h划痕距离），计算细胞迁移率。细胞迁移率=（0h划痕距离-24h划痕距离）/0h 划痕距离×100%。每组设3个复孔，实验重复3次，取平均值。
1.8统计学方法采用SPSS21.0统计软件。计量资料以-x±s表示，两样本均数比较采用独立样本t 检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1DU145、RWPE-1细胞lncRNA PVT1mRNA表达比较DU145、RWPE-1细胞lncRNA PVT1mRNA 相对表达量分别为
3.41±0.81、1.00±0.21，DU145细胞lncRNA PVT1mRNA相对表达量明显高于RWPE-1细胞（t=7.938，P<0.01）。
2.2两组lncRNA PVT1表达比较观察组与对照组lncRNA PVT1mRNA相对表达量分别1.35±0.31、
3.14±0.47，lncRNA PVT1蛋白相对表达量分别为0.24±0.04、0.88±0.05。观察组lncRNA PVT1mRNA和蛋白相对表达量均低于对照组（t分别为5.053、18.110，P均<0.01）。
2.3两组细胞增殖活性比较观察组培养60、72h 时细胞增殖活性均低于对照组同期（P均<0.01），而两组培养12、24、36、48h时细胞增殖活性比较差异均无统计学意义（P均>0.05）。见表1。
2.4两组细胞侵袭能力比较观察组穿膜细胞数为（79.3±6.4）个，对照组为（144.7±9.5）个，观察组穿膜细胞数明显低于对照组（t=6.982，P<0.05）。
2.5两组细胞迁移能力比较观察组细胞迁移率为（2
proliferation
3.3±2.1）%，对照组为（57.3±3.1）%，观察组细胞迁移率明显低于对照组（t=11.782，P<0.01）。3讨论
前列腺癌的发病率在全球男性所有恶性肿瘤中居第2位，病死率居第5位［7］。近年来随着我国人口老龄化加剧，前列腺癌的发病率呈逐年上升趋势，已成为我国男性第五大常见恶性肿瘤［1］。内分泌是目前前列腺癌的主要方法，几乎所有患者在疾病早期属于雄激素依赖型，雄激素剥夺疗法的缓解率超过80%［8］。但经过中位生存期14.30个月以后，多数患者发展为去势抵抗性前列腺癌，变得难以控制且易于转移，这是导致晚期前列腺癌死亡的主要原因。由于前列腺癌发病的分子机制尚不完全清楚，临床对于去势抵抗性前列腺癌缺乏有效的手段［9］。因此，深入研究前列腺癌的发病机制，对其早期诊断和后续均具有重要意义。
lncRNA是一类转录本长度超过200nt的非编码RNA分子，虽然不编码蛋白，但可以RNA的形式在表观遗传调控、转录调控、转染后调控等层面上调控基因的表达。近年研究证实，lncRNA可作为致癌基因或抑癌基因参与人类多种肿瘤的发生、发展［10］。PVT1是lncRNA家族成员之一，是人类多种疾病发生、发展过程中的重要调控分子［11］。在乳腺癌和卵巢癌细胞中抑制lncRNA PVT1表达，可促进肿瘤细胞凋亡［12］。在结直肠癌细胞中下调lncRNA PVT1表达可激活转录生长因子β信号通路和凋亡信号
表1两组培养不同时间细胞增殖活性比较（-x±s）
组别
对照组观察组
细胞增殖活性
培养12h
0.11±0.03
0.12±0.03
培养24h
0.10±0.03
0.18±0.05
培养36h
0.40±0.04
0.39±0.04
培养48h
0.56±0.04
0.52±0.05
培养60h
0.72±0.08
0.64±0.04*
培养72h
0.96±0.08
0.70±0.05*
注：与对照组同时间比较，*P<0.01。
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通路，促进结直肠癌细胞凋亡［13］。有研究发现，lncRNA PVT1在膀胱癌组织中异常表达，并与肿瘤临床分期和淋巴结转移有关，是预测膀胱癌总体生存率的独立危险因素［14］。前期研究发现，前列腺癌组织lncRNA PVT1表达明显高于癌旁正常组织，并且lncRNA PVT1高表达与前列腺癌淋巴结转移和远处转移密切相关［15］。由此推测，lncRNA PVT1可能参与前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移。但目前相关证据不足。
本研究结果发现，DU145细胞lncRNA PVT1 mRNA相对表达量明显高于RWPE-1细胞，与之前在前列腺癌组织中的报道一致。通过瞬时转染技术将lncRNA PVT1siRNA转染至DU145细胞中，下调lncRNA PVT1表达并通过G418筛选出稳转细胞株，进一步观察lncRNA PVT1表达对DU145细胞增殖、侵袭和迁移的影响，结果发现，观察组培养60、72h 时细胞增殖活性明显低于对照组同期，即下调lncRNA PVT1表达能够抑制前列腺癌细胞增殖；观察组穿膜细胞数和细胞迁移率均低于对照组，即下调lncRNA PVT1表达能够抑制前列腺癌细胞侵袭和迁移。结果表明lncRNA PVT1可促进DU145细胞增殖、侵袭和迁移，与以往在卵巢癌细胞［16］、非小细胞肺癌细胞［17］中的报道一致。但目前对lncRNA PVT1在前列腺癌中的具体作用机制尚不清楚，还需进一步研究。
综上所述，前列腺癌细胞lncRNA PVT1高表达，下调lncRNA PVT1表达可抑制前列腺癌细胞增殖、侵袭和迁移。lncRNA PVT1有望成为前列腺癌早期诊断和靶向潜在的肿瘤生物标志物。
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（收稿日期：2020-10-16）
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