4112  ｜中国组织工程研究｜第25卷｜第26期｜2021年9月
miR-98-5p 促进成骨细胞增殖和分化的可能及机制
郑  峰，张富财，许  喆
文题释义：
骨折愈合：成骨细胞和破骨细胞在骨折愈合及重塑中发挥重要作用，成骨细胞为间充质细胞，在骨折愈合的骨形成中参与形成新的骨骼，破骨细胞可分泌蛋白酶参与软骨的吸收和重塑。细胞因子和生长因子的释放均可影响成骨细胞和破骨细胞活性，进而影响骨折愈合过程。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶3β(PI3K/AKT/GSK-3β)信号通路：PI3K/AKT/GSK-3β信号通路在细胞的生长、增殖和分化中起着重要作用，其中PI3K/AKT 可通过下游mTOR 途径促进细胞存活，参与细胞的代谢、增殖和血管生成。GSK-3β是一种多功能丝氨酸/苏氨酸激酶，可调节能量代谢、细胞生长和凋亡，是PI3K/AKT 的下游底物和效应器。机械应力通过介导PI3K/Akt/GSK-3β信号通路可调节骨髓间充质干细胞的成骨过程。
摘要
背景：miRNA-98-5p 可抑制高迁移率族AT HOOK 蛋白2(high mobility group AT-HOOK 2，HMGA2)。
磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶3β(phosphatidylinositol 3-kinase/alkaline phosphatase/glycogen synthase kinase-3β，PI3K/AKT/GSK-3β)信号通路参与细胞增殖过程。骨折愈合过程中，miR-98-5p 是否通过激活HMGA2作用于PI3K/Akt/GSK-3β通路来促进成骨细胞的增殖仍不清楚。目的：探讨miR-98-5p 调控HMGA2和PI3K/AKT/GSK-3β通路促进成骨细胞增殖和分化的机制。
方法：取MC3T3-E1细胞，通过Lipofectamine 2000分别转染miR-98-5p 模拟物和HMGA2质粒到MC3T3-E1细胞，分别为miR-98-5p 转染组和HMGA2过表达组；用二甲基亚砜处理的MC3T3-E1细胞及Scramblez 乱序质粒转染至MC3T3-E1，分别为转染对照组和空白质粒组；采用脂质体瞬时转染miR-98-5p 抑制剂，作为miR-98-5p 抑制剂组；不做任何处理的MC3T3-E1细胞作为空白对照组。
结果与结论：①空白对照组和转染对照组的HMGA2、PI3K/Akt/GSK-3β、碱性磷酸酶活性及mRNA 水平差异无显著性意义，与转染对照组比，miR-98-5p 转染组HMGA2和PI3K/Akt/GSK-3β蛋白表达、细胞分化、细胞增殖，碱性磷酸酶活性及mRNA 均显著降低；②Targetscan7.1预测miR-98-5p 与HMGA2相互作用结果显示，与转染对照组比，miR-98-5p 转染组的HMGA2蛋白和mRNA 均降低；与miR-98-5p 转染组比，miR-98-5p 抑制剂组的HMGA2蛋白和mRNA 均增加；③空白对照组和空白质粒组的成骨细胞增殖、碱性磷酸酶活性及mRNA 水平差异无显著性意义，与空白质粒组比，HMGA2过表达组的PI3K/Akt/GSK-3β表达、细胞分化程度、MC3T3-E1细胞增殖、碱性磷酸酶活性及mRNA 水
平均显著增加；④结果显示miR-98-5p 可抑制MC3T3-E1细胞的HMGA2和PI3K/Akt/GSK-3β表达，同时抑制细胞的增殖和分化，HMGA2可能是miR-98-5p 的直接作用靶点。
关键词：成骨细胞；小微RNA98-5p ；HMGA2；磷脂酰肌醇3-激酶；蛋白激酶B ；糖原合成酶激酶3β；转染；MC3T3-E1细胞；增殖；分化缩略语：高迁移率族AT HOOK 蛋白2：high mobility group AT-HOOK 2，HMGA2；磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶3β：phosphatidylinositol 3-kinase/alkaline phosphatase/glycogen synthase kinase-3β，PI3K/AKT/GSK-3β
/10.12307/2021.107投稿日期：2020-09-11  送审日期：2020-09-12采用日期：2020-10-30 在线日期：2021-01-18中图分类号： R446；R363；R683文章编号：
2095-4344(2021)26-04112-06文献标识码：A
青海省人民医院骨科，青海省西宁市  810007
第一作者：郑峰，男，1978年生，黑龙江省庆安县人，2014年哈尔滨医科大学毕业，硕士，主任医师，主任，主要从事创伤后骨再生机制以及骨质疏松性骨折方面的研究。
通讯作者：郑峰，青海省人民医院骨科，青海省西宁市  810007/0000-0003-1033-8059 (郑峰)
基金资助：青海省基础研究计划项目(2020-ZJ-755)，项目负责人：郑峰
引用本文：郑峰，张富财，许喆. miR-98-5p 促进成骨细胞增殖和分化的可能及机制[J].中国组织工程研究，2021，25(26):4112-4117.
研究原著
0  引言  Introduction
骨折愈合是一个复杂的动态过程，多种类型的细胞及其细胞因子参与调控这一过程[1-2]，其中成骨细胞和破骨细胞在骨骼重塑中发挥重要作用[3-4]。成骨细胞属于间充质细胞，可通过参与形成新的骨骼在骨折愈合的骨形成中起主要作用[5-7]；破骨细胞则通过分泌蛋白酶参与软骨的吸收和重塑。骨折后细胞迁移、分化、组织愈合以及细胞因子和生长因子的释放等恢复过程主要取决于成骨细胞的活性[8]。
微小RNA(MicroRNA，miRNA)是一种小的非编码RNA 分子，参与增殖、迁移、分化和凋亡等多种细胞的生理病理过程[9-11]。miR-98-5p是miRNAs家族近年来在肿瘤和骨骼重塑研究领域较为热门的成员之一，其可通过抑制高迁移率族AT HOOK蛋白2(high mobility group AT-hook 2，HMGA2)表达来促进甲状腺乳头状癌细胞凋亡，抑制细胞迁移和生长[12]。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/糖原合成酶激酶3β(phosphatidylinositol 3-kinase/alkaline phosphatase/glycogen synthase kinase-3β，PI3K/AKT/GSK-3β)信号通路参与细胞增殖、分化、侵袭和凋亡相关的信号转导过程[13]，而HMGA2可促进PI3K/AKT/GSK-3β信号通路激活来促进急性髓系白血病细胞的增殖[14]。那么，在骨折愈合过程中，miR-98-5p是否通过激活HMGA2作用于PI3K/Akt/GSK-3β通路来促进成骨细胞的增殖，目前尚不清楚。此次实验拟探讨miR-98-5p 促进成骨细胞增殖分化的可能及其机制。
1  材料和方法  Materials and methods
1.1    设计体外观察细胞实验。
1.2  时间及地点实验于2019年9月至2020年7月在青海省高原医学应用基础重点实验室完成。
1.3  材料
1.3.1  细胞小鼠颅顶前成骨细胞亚克隆14(MC3T3-E1 subclone 14)细胞，购于上海盈湾生物科技公司。
1.3.2  实验使用的主要试剂  α-MEM 培养基购自上海慧颖生物科技有限公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；L-甘油磷酸酯、地塞米松、抗坏血酸均购自美国Sigma公司；Lipofectamine 2000、TRIzol试剂、TaqMan MicroRNA反转录试剂盒、荧光(RiboGreen)定量检测试剂盒均购自美国Invitrogen公司；HMGA2质粒购自湖南丰晖生物科技有限公司；二甲基亚砜、多聚甲醛和茜素红均购自海信帆生物科技有限公司；CCK-8购自上海翊圣生物科技有限公司；碱性磷酸酶活性试剂盒购自美国赛默飞世尔科技公司；RIPA 裂解液购自北京普利莱基因技术有限公司。
1.4  方法
1.4.1  细胞培养  MC3T3-E1采用α-MEM 培养基(含体积分数10%胎牛血清、青霉素1×105 U/L，链霉素1×105 U/L)
MicroRNA-98-5p promotes osteoblast proliferation and differentiation: possibilities and mechanisms Zheng Feng, Zhang Fucai, Xu Zhe
Department of Orthopedics, Qinghai Provincial People’s Hospital, Xining 810007, Qinghai Province, China
Zheng Feng, Master, Chief physician, Department of Orthopedics, Qinghai Provincial People’s Hospital, Xining 810007, Qinghai Province, China Corresponding author: Zheng Feng, Department of Orthopedics, Qinghai Provincial People’s Hospital, Xining 810007, Qinghai Province, China
Abstract
BACKGROUND: MicroRNA-98-5p (miR-98-5p) can inhibit the high mobility group AT-HOOK 2 (HMGA2). The phosphatidylinositol 3-kinase/alkaline phosphatase/ glycogen synthase kinase-3β (PI3K/AKT/GSK-3β) signaling pathway is involved in cell proliferation. During the fracture healing process, it is unclear whether miR-98-5p can act on the PI3K/Akt/GSK-3β pathway by activating HMGA2 to promote the proliferation of osteoblasts.
OBJECTIVE: To investigate the mechanisms of microRNA-98-5p (miR-98-5p) in promoting osteoblast proliferation and differentiation by regulating HMGA2 and PI3K/Akt/GSK-3β pathway.
METHODS: MC3T3-E1 cells transfected with miR-98-5p mimics and HMGA2 plasmid by Lipofectamine 2000 were divided into a miR-98-5p mimics group and a HMGA2 overexpression group, respectively. MC3T3-E1 cells transfected with dimethyl sulfoxide and scrambled plasmids were divided into a mimic control group and a scramble group. Cells transiently transfected with miR-98-5p inhibitor using liposomes were as a miR-98-5p inhibitor group. Normal MC3T3-E1 cells without treatment were used as a blank control group.
RESULTS AND CONCLUSION: There were no significant differences in HMGA2, PI3K/Akt/GSK-3β, alkaline phosphatase activity and mRNA level between
the blank control group and the mimic control group. Compared with the mimic control group, the HMGA2 and PI3K/Akt/GSK-3β protein expression, cell differentiation and proliferation, alkaline phosphatase activity and mRNA level were significantly reduced in the miR-98-5p mimics group. The interaction between miR-98-5p and HMGA2 predicted by Targetscan7.1 showed that compared with the mimic control group, the HMGA2 protein and mRNA were reduced in the miR-98-5p mimic group, while compared with the miR-98-5p mimic group, the HMGA2 protein and mRNA had an increase in the miR-98-5p inhibitor group. There were no significant differences in osteoblast proliferation, alkaline phosphatase activity and mRNA between the blank control group and the scramble group. C
ompared with the scramble group, the PI3K/Akt/GSK-3β expression, cell differentiation and proliferation, alkaline phosphatase activity and mRNA in the HMGA2 overexpression group were significantly increased. To conclude, miR-98-5p can inhibit the HMGA2 and PI3K/Akt/GSK-3β expressions in MC3T3-E1 cells, inhibit cell proliferation and differentiation. HMGA2 is possible the direct target of miR-98-5p.
Key words: osteoblasts; microRNA-98-5p; high mobility group AT-HOOK 2; phosphatidylinositol 3-kinase; protein kinase B; glycogen synthase kinase 3β; transfection; MC3T3-E1 cells; proliferation; differentiation
Funding: the Basic Research Plan of Qinghai Province, No. 2020-ZJ-755 (to ZF)
How to cite this article: ZHENG F, ZHANG FC, Xu Z. MicroRNA-98-5p promotes osteoblast proliferation and differentiation: possibilities and mechanisms. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2021;25(26):4112-4117.
Chinese Journal of Tissue Engineering Research｜Vol 25｜No.26｜September 2021｜4113
在无菌条件下培养，培养箱环境为37 ℃、体积分数5% CO2。
1.4.2  成骨分化及转染当MC3T3-E1细胞处于对数生长期时，重悬细胞并种入6孔板中(每孔约6×106细胞)。当细胞生长到80%的融合度时，使用体积分数10%胎牛血清、5 mmol/L L-甘油磷酸酯、100 nmol/L地塞米松和50 g/L抗坏血酸配制的成骨诱导培养基培养14 d。通过Lipofectamine 2000分别转染50 nmol/L的miR-98-5p模拟物或50 nmol/L 的HMGA2质粒到MC3T3-E1细胞，在MC3T3-E1细胞过表达miR-98-5p或HMGA2，分别为miR-98-5p转染组和HMGA2过表达组；用二甲基亚砜处理的MC3T3-E1细胞或Scramblez 乱序质粒转染至MC3T3-E1作为对照，分别为转染对照组和空白质粒组。
1.4.3  细胞活力检测实验将成骨分化诱导后的MC3T3-E1细胞接种到96孔板中(每孔约4×104个细胞)，设置转染对照组、miR-98-5p转染组及HMGA2过表达组，培养48 h后，用100 µL α-MEM培养基与10 µL CCK-8溶液在37 ℃下孵育细胞30 min，采用荧光分光光度计检测各组450 nm的吸光度值，所有组别设5个复孔。
1.4.4  成骨细胞增殖检测实验将成骨分化诱导后的MC3T3-E1细胞接种到96孔板中(每孔约4×104个细胞)，设置转染对照组、miR-98-5p转染组及HMGA2过表达组，培养48 h后，用冷PBS洗涤细胞2次，40 g/L多聚甲醛固定10 min，室温下用50 mmol/L茜素红(pH 4.2)染10 min，获得图像，测量上清液570 nm波长处的吸光度，所有组别设5个复孔。
1.4.5  成骨细胞分化检测实验成骨分化诱导后的MC3T3-E1细胞接种到96孔板中(每孔约4×104个细胞)，
设置转染对照组、miR-98-5p转染组及HMGA2过表达组，取各组细胞培养上清液，严格按照碱性磷酸酶活性试剂盒说明书操作，利用微板法于520 nm处测定碱性磷酸酶活性，所有组别设5个复孔。
1.4.6  免疫印迹分析在细胞处理结束后，使用RIPA裂解液提取MC3T3-E1成骨分化细胞的蛋白质，使用BCA蛋白浓度检测试剂盒对蛋白质进行定量和变性，将蛋白样品加入到10% SDS-PAGE凝胶上来分离等量的蛋白质，结束后把蛋白电转到PVDF膜上，在室温下用5%的脱脂牛奶封闭聚偏氟乙烯膜1 h，在4 ℃下使用0.01 mol/L PBS稀释的一抗溶液孵育过夜，孵育完成后用辣根过氧化物酶结合的二抗孵育，滴加ECL显液，在暗室中使用曝光夹和胶片让蛋白条带显影，使用Image J软件对蛋白条带进行定量分析，所有组别设5个复孔。
1.4.7  实时荧光定量聚合酶链反应严格按照TRIzol试剂说明书从处理结束后的细胞中提取总RNA，采用TaqMan MicroRNA 反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA，合成的cDNA采用荧光(RiboGreen)定量检测试剂盒进行定量检测。蛋白激酶B正义链：5′-CCG AAT TCA TGT TGG CCT GTT CAA CT-3’，反义链：5′-ATG TCG ACT TAG TTA TTT TCA TAA TAC CAA ATT CC-3’；HMGA2 正义链：5′-TCC CTC TAA AGC AGC TCA AAA-3′，反义链：5′-ACT TGT TGT GGC CAT TTC CT-3’；GAPDH 正义链：5′-CTT TGG TAT CGT GGA AGG ACT C-3′，反义链：5′-GTA GAG GCA GGG ATG ATG TTC T-3’。引物均由南京金斯瑞公司合成。所有组别重复检测5次。
1.4.8  miR-98-5p靶点预测采用TargetScan7.1在线工具(/vert_71/)预测 miR-98-5p靶点，物种选项选择“Mouse”，以microRNA名进行比对分析，预测靶基因序列中miR-98-5p与HMGA2的mRNA 3’UTR配对位点。
1.5  主要观察指标  MC3T3-E1细胞的增殖、分化、HMGA2和PI3K/Akt/GSK-3β蛋白表达。
1.6  统计学分析数据分析采用美国GraphPad Software公司GraphPad Prism 7.0 软件。所有结果数据以x-±s表示。多组间差异比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验，P <0.05为差异有显著性意义。
2  结果  Results
2.1  miR-98-5p模拟物对MC3T3-E1细胞HMGA2和PI3K/Akt/ GSK-3β通路的影响为研究miR-98-5p在MC3T3-E1细胞中对HMGA2和PI3K/Akt/GSK-3β通路的影响，采用miR-98-5p 模拟物，在诱导成骨细胞MC3T3-E1分化后，空白对照组和转染对照组的HMGA2和PI3K/Akt/GSK-3β差异无显著变化(P > 0.05)，与转染对照组相比，miR-98-5p转染组的HMGA2和PI3K/Akt/GSK-3β蛋白显著降低(P < 0.05)，见图1。表明 miR-98-5p可显著抑制成骨细胞MC3T3-E1的HMGA2蛋白表达，同时抑制PI3K/Akt/GSK-3β通路。
2.2  miR-98-5p模拟物可显著抑制MC3T3-E1细胞的增殖和分化为探讨miR-98-5p对MC3T3-E1细胞的增殖和分化的影响，成功构建了miR-98-5p转染细胞。用CCK-8检测细胞增殖，空白对照组和转染对照组细胞数量差异无显著性意义(P > 0.05)，与转染对照组相比，miR-98-5p转染组细胞数量显著降低(P < 0.05)，见图2。荧光显微镜下观察成骨细胞分化，发现0 h和24 h时各组细胞分化程度差异无显著性意义(P > 0.05)，空白对照组和转染对照组48 h和72 h细胞分化程度差异无显著性意义(P > 0.05)，与转染对照组相比，miR-98-5p转染组的分化程度显著降低(P < 0.05)。空白对照组和转染对照组MC3T3-E1细胞的增殖差异无显著性意义(P > 0.05)，与转染对照组相比，miR-98-5p 转染组MC3T3-E1细胞的增殖明显降低(P < 0.05)。空白对照组和转染对照组成骨细胞增殖标记物碱性磷酸酶活性及mRNA差异无显著性意义(P > 0.05)；与转染对照组相比，miR-98-5p转染组碱性磷酸酶活性及mRNA显著降低(P < 0.05)。见图3。这些研究表明miR-98-5p可显著抑制成骨细胞MC3T3-E1的增殖和分化。
Research Article
4114｜中国组织工程研究｜第25卷｜第26期｜2021年9月
2.3  miR-98-5p模拟物和抑制剂对HMGA2的靶点调控作用Targetscan7.1在线工具预测了miR-98-5p与HMGA2相互作用，结果验证了miR-98-5p对HMGA2的调控作用。与转染对照组相比，miR-98-5p转染组的HMGA2蛋白和mRNA表达显著降低(P < 0.05)，与miR-98-5p转染组相比，miR-98-5p抑制剂组的
proliferation
HMGA2蛋白和mRNA表达显著增加(P < 0.05)，见图4。这表明miR-98-5p可特异性抑制HMGA2蛋白表达，HMGA2是miR-98-5p的直接作用靶点且直接抑制HMGA2蛋白表达。
2.4  HMGA2过表达可促进MC3T3-E1细胞PI3K/Akt/GSK-3β通路研究结果表明，miR-98-5p可抑制HMGA2蛋白表达，下调PI3K/Akt/GSK-3β通路[15-16]，因此有必要考察HMGA2对PI3K/Akt/GSK-3β通路的影响。在MC3T3-E1细胞中过表达HMGA2，空白对照组和空白质粒组PI3K/Akt/GSK-3β差异无显著性意义(P > 0.05)；与空白质粒组相比，HMGA2过表达组的PI3K/Akt/GSK-3β表达水平显著增加(P < 0.05)，见图5。这表明miR-98-5p通过抑制HMGA2来下调PI3K/Akt/GSK-3β通路。
2.5  HMGA2过表达可显著抑制MC3T3-E1细胞的增殖和分化研究表明，miR-98-5p可抑制HMGA2蛋白表达，HMGA2可增强PI3K/Akt通路[15]，同时还可抑制成骨细胞的增殖分化[16]。MC3T3-E1细胞过表达HMGA2可增强PI3K/Akt/GSK-3β通路。为考察HMGA2过表达对成骨细胞增殖和分化的影响，以荧光显微镜观察，在0 h和24 h各组成骨细胞分化差异无显著意义(P > 0.05)，空白对照组和空白质粒组48 h和72 h时成骨细胞分化接近(P > 0.05)，与空白质粒组相比，HMGA2过表达组细胞的分化程度显著升高(P < 0.05)。成骨细胞增殖检测结果表明，空白对照组和空白质粒组增殖程度差异无显著性意义(P > 0.05)，与空白质粒组相比，HMGA2过表达组细胞增殖明显增加(P < 0.05)。空白对照组和空白质粒组的碱性磷酸酶活性和mRNA差异无显著性意义(P > 0.05)，与空白质粒组相比，HMGA2过表达组碱性磷酸酶活性和mRNA表达明显增加(P < 0.05)，见图6和7。
3  讨论  Discussion
骨再生是许多骨骼疾病修复过程中必不可少的步骤，如骨折和骨质疏松症[17]。虽然有许多研究探索了多种手段来这些疾病，但疗效仍然有诸多局限性[18]。有研究表明miRNAs在细胞增殖、分化和凋亡中起重要的调控作用[19-21]，其中miRNAs参与调控成骨细胞分化、骨代谢和骨形成是近年来的研究热点[22-24]，例如抑制miR-467g表达可显著促进新生骨的再生能力，同时miR-467g可通过抑制Runx2信号通路来阻止新骨再生[25]；miR-221可通过下调Runx2表达抑制成骨细胞分化和骨形成[26]。因此，miRNAs 或可成为骨退行性疾病和其他异常骨形成障碍的新靶点。
PI3K/AKT信号通路在细胞的生长、增殖和分化中起着重要作用[27]，PI3K/AKT通过下游mTOR途径促进细胞存活，参与细胞的代谢、增殖和血管生成[28-29]。抑制PI3K/AKT信号通路可逆转Mg2+对大鼠成骨细胞的保护作用[30]，激活PI3K/AKT信号通路可介导大鼠成骨细胞增殖和分化[31]。GSK-3β是一种多功能丝氨酸/苏氨酸激酶，最初被认为是糖原代谢的调节因子[32]，可调节能量代谢、细胞生长和凋亡[33]，是PI3K/AKT的下游底物和效应器[34]，GSK-3β参与了地塞米松诱导的胰腺β细胞凋亡[35]。机械应力通过介导PI3K/Akt/GSK-3β信号通路调节大鼠骨髓间充质干细胞的成骨过程[36]。
此次研究以MC3T3-E1为研究对象，经Targetscan7.1在线工具预测miR-98-5p的靶点是HMGA2，进一步取MC3T3-E1细胞通过转染miR-98-5p模拟物和HMGA2质粒，结果显示，与转染对照组相比，miR-
98-5p转染组可显著抑制HMGA2和PI3K/Akt/GSK-3β蛋白表达，与转染对照组相比，miR-98-5p转染组可显著抑制MC3T3-E1细胞的增殖，与转染对照组相比，miR-98-5p转染组可显著抑制碱性磷酸酶活性，与转染对照组相比，miR-98-5p转染组可显著抑制碱性磷酸酶mRNA表达。与miR-98-5p转染组相比，miR-98-5p抑制剂组的HMGA2蛋白和mRNA表达显著增加。与空白质粒组相比，HMGA2过表达组的PI3K/Akt/GSK-3β表达显著增加。与空白质粒组相比，HMGA2过表达组细胞的分化程度显著升高。与空白质粒组相比，HMGA2过表达组可显著促进MC3T3-E1细胞增殖。与空白质粒组相比，HMGA2过表达可显著增强碱性磷酸酶活性和上调碱性磷酸酶mRNA 表达，可见下调miR-98-5p可以显著增强下游HMGA2表达，激活PI3K/Akt/GSK-3β通路，参与成骨细胞的增殖和分化，即miR-98-5p可能通过抑制HMGA2及下游PI3K/Akt/ GSK-3β信号通路，减弱成骨细胞的增殖和分化，抑制miR-98-5p是促进骨折愈合的重要靶点。类似的文献也显示，在骨折愈合过程中，miR-98-5p可抑制被诱导的成骨细胞的分化和增殖，HMGA2过表达可逆转miR-98-5p的作用，提示 miR-98-5p可能通过靶向HMGA2抑制成骨分化和成骨细胞生长来阻止骨再生[37-38]。miR-98-5p转染能够抑制Hep-2细胞的增殖，抑制肿瘤的生长，与miR-98-5p抑制HMGA2而抑制喉鳞癌的进程类似，miR-98-5p可能成为喉鳞癌诊治的新靶点[39]，但miR-98-5p及其调控HMGA2在成骨细胞增殖分化过程中调控的信号通路仍需深入研究，例如下一步研究有必要将miR-98-5p及HMGA2共转染，考察miR-98-5p 对HMGA2蛋白表达的影响。
综上所述，miR-98-5p可抑制HMGA2及PI3K/Akt/GSK-3β通路，干扰miR-98-5p可促进HMGA2蛋白表达，增强PI3K/ Akt/GSK-3β通路，参与促进成骨细胞增殖和分化的作用。此次研究为骨折愈合的研究和提供了新思路。但HMGA2调控PI3K/Akt/GSK-3β通路参与保护软骨细胞的具体作用机制仍然需要进一步研究。
Chinese Journal of Tissue Engineering Research｜Vol 25｜No.26｜September 2021｜4115
4116  ｜中国组织工程研究｜第25卷｜第26期｜2021年9月
研究原著
图注：图中空白对照组和转染对照组细胞数量相似，与转染对照组相比，miR-98-5p 转染组细胞数量明显减少
图 2｜miR-98-5p 对MC3T3-E1细胞的增殖影响(×200)
Figure 2 ｜Inhibitory effect of microRNA-98-5p on proliferation of MC3T3-E1 cells (×200)
空白对照组                  转染对照组                miR-98-5p 转染组
图注：图中A 为免疫印迹分析HMGA2、PI3K/Akt/GSK-3β蛋白相对表达；B 为HMGA2蛋白相对表达；C 为PI3K 蛋白相对表达；D 为Akt 蛋白相对表达；E 为GSK-3β蛋白相对表达。与空白对照组
和转染对照组相比，a
P < 0.05
图 1｜MC3T3-E1细胞中miR-98-5p 对HMGA2和PI3K/Akt/GSK-3β通路的抑制作用(n =5)
Figure 1 ｜Inhibitory effect of microRNA-98-5p on HMGA2 and PI3K/Akt/GSK-3β pathways in MC3T3-E1 cells (n =5)
P I 3K 蛋白相对表达(与空白对照组吸光度的百分比)
150100500
a
HMGA2PI3K Akt GSK-3ββ-actin 空白对  转染对  miR-98-5p 照组    照组    转染组
空白对照组  转染对照组  miR-98-5p 转染组
H M G A 2蛋白相对表达(与空白对照组吸光度的百分比)
150100500
a
150100500
G S K -3β蛋白相对表达(与空白对照组吸光度的百分比
)
150100500
A k t 蛋白相对表达(与空白对照组吸光度的百分比)
a
A
B
C D
E
图注：图中A 为免疫印迹分析PI3K 、Akt 和GSK-3β蛋白相对表达，B -D 分
别为PI3K 、Akt 和GSK-3β的蛋白相对表达情况。与空白质粒组相比，a
P < 0.05
图 5｜ HMGA2过表达对MC3T3-E1细胞PI3K/Akt/GSK-3β通路的促进作用(n =5)
Figure 5 ｜ Overexpression of HMGA2 promotes the expression of PI3K/Akt/GSK-3β pathway in MC3T3-E1 cells (n =5)
A
空白对照组  转染对照组  miR-98-5p 转染组
PI3K Akt
GSK-3ββ-actin
空白对照组
转染对照组
miR-98-5p 转染组
a
a
a
120 kD 56 kD 47 kD 43 kD
200150100500
200150100500
200150100500
P I 3K 相对表达
A K T 相对表达
G S K -3β相对表达
B
C
D
B 为免疫印迹分析各组细胞HMGA2蛋白相对表达，
C 为各组细胞HMGA2蛋白相对表达，D
为各组细胞HMGA2 mRNA 相对表达。与转染对照组相比，a
P < 0.05；与miR-98-5p 转染组相比，b P < 0.05
图 4｜ miR-98-5p 对HMGA2的mRNA 直接调控作用(n =5)
Figure 4 ｜ Direct regulation of HMGA2 mRNA by microRNA-98-5p (n =5)
空白对照组转染对照组miR-98-5p 转染组
b
HMGA2β-actin
18 kD 43 kD
图注：图中A 为各组细胞不同时间的细胞活力，B 为各组细胞24 h 的细胞活力，C 为各组细胞碱性磷酸酶活性，D 为各组细胞碱性磷酸酶mRNA 表达。与转染对照组相比，a P < 0.05
图 3｜ miR-98-5p 对MC3T3-E1细胞的增殖和分化的抑制作用(n =5)
Figure 3 ｜Inhibitory effect of microRNA-98-5p on proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells (n =5)
A
B
碱性磷酸酶活性(520 n m 吸光度值)
碱性磷酸酶m R N A 表达水平(与空白对照组吸光度值的比值)
细胞活力(450 n m 吸光度值)
0.60.40.20
1.5
1.0
0.5
空白对照组转染对照组
miR-98-5p 转染组
150100500
a
C
D
细胞活力(450 n m 吸光度值)
2.01.51.00.50
空白对照组转染对照组
miR-98-5p 转染组
a
a 0        20 h      40 h      60 h      80 h
空白对照组                空白质粒组                HMGA2过表达组
图注：图中空白对照组和空白质粒组细胞的分化程度相当，与空白质粒组相比，HMGA2过表达组细胞的分化程度显著升高
图 6｜ HMGA2过表达对MC3T3-E1细胞的增殖影响(×200)
Figure 6 ｜Inhibitory effect of HMGA2 overexpression on proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells (×200)
图注：图中A 为各组不同时间的细胞活力，B 为碱性磷酸酶活性，C 为碱性磷酸酶mRNA 相对表达。
与空白质粒组相比，a
P < 0.05
a
200
150100500
碱性磷酸酶 活性
B
C
细胞活力(450 n m 吸光度值)
3
210a
a
A
图 7｜ HMGA2过表达可促进MC3T3-E1细胞的增殖和分化(n =5)
Figure 7 ｜ Overexpression of HMGA2 can promote the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells (n =5)
过表组
空白对照组空白质粒组
HMGA2过表达组
2.01.51.00.50
碱性磷酸酶 m R N A 相对表达
转染
对
照
组m i R -98-5p
转染组
m i R -98-5p 抑
制剂
组

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