doi：10.3969/j.issn.l000484X.2021.03.011
LncRNA TMPO-AS1通过调节miR-204-3p影响肺癌细胞的增殖、凋亡和侵袭
邓俊亮华美香①陈键腾（南方医科大学附属新会医院呼吸内科，江门529100）
proliferation中图分类号R734.2文献标志码A文章编号1000-484X(2021)03-0319-07
[摘要]目的：探究长链非编码RNA(lncRNA)TMPO-ASl通过调节miR-204-3p的表达对肺癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。方法：实时荧光定量PCR(qPCR)检测人肺癌细胞系A549、H1975、H1299和H1650和人正常支气管上皮细胞系HBE 中TMPO-AS1的表达水平。采用脂质体转染技术沉默A549细胞中TMPO-AS1,qPCR检测TMPO-AS1和miR-204-3p的表达情况，荧光素酶报告实验检测TMPO-AS1和miR-204-3p的靶向关系，噻唑蓝比法(MTT)、流式细胞术和Transwell实验分别检测沉默TMPO-AS1对A549细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响,Western blot检测A549细胞中PCNA、Ki鄄67、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9.MMP-2和MMP-9的表达。结果：人肺癌细胞系中TMPO-AS1的表达水平明显高于人正常支气管上皮细胞系(P<0.05)，且肺癌A549细胞中TMPO-AS1的基础表达量最高，选择A549细胞用于后续实验。沉默TMPO-AS1可明显促进miR-204-3p的表达(P<0.05)，荧光素酶报告实验显示,TMPO-AS1能够降低miR-204-3p野生型细胞的相对荧光素酶活性(P< 0.05)o沉默TMPO-AS1能够明显抑制A549细胞增殖和侵袭能力(P<0.05)，降低增殖相关蛋白PCNA.Ki-67及侵袭
相关蛋白MMP-2、MMP-9的表达(P<0.05)；此外，沉默TMPO-AS1可促进A549细胞凋亡及Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表达(P<0.05)o结论：沉默TMPO-AS1能够通过靶向促进miR-204-3p的表达抑制肺癌细胞增殖和侵袭，并诱导细胞凋亡。
[关键词]LncRNA TMPO-AS1；miR-204-3p；肺癌细胞；增殖；凋亡；侵袭
LncRNA TMPO-AS1affects proliferation,apoptosis and invasion of lung cancer cells by modulating miR-204-3p
DENG Jun-Liang,HUA Mei-Xiang,CHEN Jian-Teng.Department of Respiratory Medicine,Xinhui Hospital,Southern Medical University, Jiangmen529100,China
[Abstract]Objective:To investigate the effects of long-chain non-coding RNA(lncRNA)TMPO-AS1on proliferation, apoptosis and invasion of lung cancer cells by regulating the expression of miR-204-3p.Methods：Real-time quantitative PCR(qPCR) was used to detect the expression levels of TMPO-AS1in human lung cancer cell lines A549,H1975,H1299and H1650and human normal bronchial epithelial cell line HBE.The liposome transfection technique was used to silence of TMPO-AS1in A549cells.The expression of TMPO-AS1and miR-204-3p was detected by qPCR.The luciferase reporter assay was used to detect the targeting relationship between TMPO-AS1and miR-204-3p.Thi
azole blue colorimetric assay(MTT),flow cytometry and Transwell assay were used to detect the effect of silencing TMPO-AS1on proliferation,apoptosis and invasion of A549cells.Western blot was used to detect expressions of PCNA,Ki-67,Cleaved Caspase-3, Cleaved Caspase-9,MMP-2and MMP-9in A549cells.Results:The expression level of TMPO-AS1in human lung cancer cell line was significantly higher than that in human normal bronchial epithelial cell line(P<0.05), and the expression of TMPO-AS1was the highest in lung cancer A549cells.A549cells were selected for subsequent experiments.Silencing TMPO-AS1significantly promoted the expression of miR-204-3p(P<0.05).Luciferase reporter assay showed that TMPO-AS1could decrease the relative luciferase activity of miR-204-3p wild-type cells(P<0.05).Silencing TMPO-AS1 significantly inhibited the proliferation and invasion of A549cells(P<0.05),and decreased the expression of proliferation-related proteins PCNA,Ki-67and invasion-related proteins MMP-2and MMP-9(P<0.05).TMPO-AS1promoted apoptosis of A549cells and expression of Cleaved Caspase-3and Cleaved Caspase-9(P<0.05).Conclusion:Silencing TMPO-AS1can inhibit the proliferation and invasion of lung cancer cells and induce apoptosis by targeting the expression of miR-204-3p.
[Key words]LncRNA TMPO-AS1；miR-204-3p；Lung cancer cells；Proliferation；Apoptosis；Invasion
①南方医科大学附属新会医院神经内科，江门529100o
作者简介：邓俊亮，男，医学硕士，副主任医师，主要从事慢性阻塞性肺疾病研究，E-mail:dvvsi6f@163。
肺癌是一种常见的恶性肿瘤，是全球范围内与癌症相关死亡的主要原因。根据肺癌的分化程度和形态特征，其可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，在
所有肺癌患者中，有85%是非小细胞肺癌［l］o大多数非小细胞肺癌患者表现为局部晚期或转移性疾病，可选择的方式有限，导致患者的5年总生存率较低［2］o因此，了解非小细胞肺癌的发病机制，寻新的对提高患者生存率具有重要意义。越来越多的证据表明，非小细胞肺癌的发生和发展涉及许多分子变化，例如由表观遗传调控诱导的基因表达的改变［3"］。近年来，已有研究证明长链非编码RNA（long noncoding RNA,lncRNA）直接参与肿瘤的发展和转移过程［5］。胸腺生成素反义转录本1（thymopoietin antisense transcript1,TMPO-AS1）是一种与DNA复制和细胞周期进程密切相关的lncRNA［6］。ZHENG等［7］分析了来自癌基因组图谱的肺腺癌患者的lncRNA表达谱和临床数据显示, TMPO-AS1在肺腺癌患者中呈高表达，且与患者预后密切相关。PENG等⑹的研究同样显示,TMPO-AS1可能是肺腺癌预后的标志分子。然而，目前未见TMPO-AS1在肺癌中的作用及可能机制的研究。生物信息学预测发现,TMPO-AS1和miR-204-3p间存在靶向结合位点，但TMPO-AS1和miR-2
04-3p是否存在靶向关系调控肺癌细胞的增殖、凋亡和侵袭鲜有报道。因此，本实验探究TMPO-AS1对肺癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响及对miR-204-3p的靶向关系。
1材料与方法
1.1材料人肺癌细胞系A549、H1975、H1299和H1650和人正常支气管上皮细胞系HBE（美国ATCC）；DMEM培养基、MTT试剂（美国Gibco公司）；胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和链霉素混合液（美国Abcam公司）；Lipofectamine TM2000转染试剂（美国Intvitrogen公司）；TMPO-AS1siRNA及阴性对照siRNA control（上海吉凯制药技术有限公司）；Trizol试剂、逆转录试剂盒（美国Thermo Fisher公司）；SYBR Green PCR Master Mix检测试剂盒（赛默飞世尔科技有限公司）；miR-204-3p-Wt和miR-204-3p-Mut荧光素酶重组载体质粒（上海生工生物工程有限公司）；荧光素酶报告检测试剂盒（美国Promega公司）；TMPO-AS1过表达重组载体质粒及空载质粒（北京赛百盛基因技术有限公司）；PCNA、Ki-67、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9、MMP-2和MMP-9单抗及HRP标记的二抗（英国Abcam公司）；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（日本TaKaRa公司）；Transwell小室（美国Coring公司）；细胞裂解液、BCA试剂盒、超敏ECL发光试剂（碧云天生物技术研究所）。
1.2方法
1.2.1细胞培养用含有10%胎牛血清、100U/ml 青霉素-链霉素的DMEM高糖培养液培养A549、H1975、H1299、H1650和HBE细胞，放置在37益、饱和湿度、5%CO2细胞培养箱中常规培养。每2d换液，待细胞生长汇合率至80%以上时用0.25%胰蛋白酶消化传代，取指数增殖期的细胞用于实验研究。
1.2.2细胞转染生长状态良好的肺癌A549细胞接种到6孔板中，过夜培养，待细胞汇合度达50%时，使用Lipofectamine TM2000转染试剂将TMPO-AS1siRNA或阴性对照siRNA control转染至A549细胞，具体步骤参照转染试剂说明书。将转染TMPO-AS1siRNA的A549细胞命名为si-TMPO-AS1组，转染siRNA control的A549细胞命名为si-NC 组，转染空脂质体的A549细胞命名为Control组，三组A549细胞转染48h行qPCR检测。
1.2.3qPCR检测收集对数生长期的A549、H1975、H1299、H1650和HBE细胞以及转染48h三组A549细胞，使用Trizol试剂分别抽提总RNA，纯化RNA，并使用分光光度计检测RNA样品的纯度和丰度。使用逆转录试剂盒将RNA反转录成cDNAo采用SYBR Green PCR Master Mix检测试剂盒行qPCR检测，反应体系为：cDNA2滋l、2xSYBR Green Mix10滋l、正向引物1滋l、反向引物1滋l、ddH2O6滋l。反应程序为：95益5min；随后95益30s、60益30s、72益10s循环40次。以GADPH为内参检测细胞中TMPO-AS1的表达水平，以U6为内参检测细胞中miR-204-3p的表达水平。所用引物序列：TMPO-AS1正向引物：5'-TCAAACCCGTAT-TACCGATCCA-3忆，反向弓I物：5'-ACCCTACATC-CAAGGTC
TCCT-3'；GADPH正向引物：5'-GGTCG-GAGTCAACGGATTTG-3'，反向引物：5'-ATGAGC-CCCAGCCTTCTCCAT-3'；miR-204-3p正向引物：5'-CGCTCGAGCCTTCTTCCTTGCCTCTCA-3'；反向弓I物5'-CAGCGGCCGCGTAAAATTTGACATGGAC-3'。U6正向弓I物:5'-AAAGCAAATCATCGGACGACC-3'；反向引物：5'-GTACAACACATTGTTTCCTCGGA-3'。反应结束后分别获得目的基因和内参基因的Ct值，采用相对定量2"AACt法进行分析。实验独立重复3次。
1.2.4荧光素酶报告实验在线生物信息学软件LncBase Experimental v.2预测TMPO-AS1在miR-204-3p上的结合位点。依据预测结果扩增miR-204-3p上含有及突变的TMPO-AS1结合位点的片段，并插入到荧光素酶报告载体上（分别为miR-
204-3p-Wt和miR-204-3p-Mut荧光素酶重组载体质粒），该部分由上海生工生物工程有限公司完成。用miR-204-3p-Wt和miR-204-3p-Mut分别与TMPO-AS1过表达重组载体质粒或空载质粒共同转染A549细胞，继续培养48h，根据荧光素酶报告检测试剂盒分别测定荧光素酶活性，计算各组细胞中相对荧光素酶活性，实验独立重复3次。
1.2.5MTT检测对数期的A549细胞接种到96孔板中，待细胞汇合率至50%时按照1.2.2进行转染,Control组,si-NC组和si-TMPO-AS1组 A549细胞转染48h时，向每孔细胞加入20滋l MTT溶液，随后放置在37益培养箱常规培养4h，取出细胞培养板，吸取细胞上清液，再加入150滋l二甲基亚砜，充分混匀后放
置到振荡仪上反应10min，使用酶标仪测定各孔吸光度值（A值），分别计算三组A549细胞活性，细胞活性（%）=实验组A值/对照组A值x100%o实验独立重复3次。
1.2.6流式细胞术检测A549细胞按照1.2.2转染48h后，分别收集三组细胞约1X105个，向细胞中加入Binding Buffer缓冲液500滋l重悬细胞，制成单细胞悬液，将500滋l细胞悬液加入流式管中，再分别向流式管中加入5滋l AnnexinV-FITC和5滋l PI 染液，混匀后于室温下避光反应15min，在1h内使用流式细胞仪检测，分析三组A549细胞凋亡率，实验独立重复3次。
1.2.7Transwell侵袭实验转染后三组A549细胞用胰蛋白酶消化，收集细胞，用不含血清的培养液重悬细胞，饥饿处理24h，将细胞浓度调整为2x 105个/ml，取200滋l细胞悬液接种到Matrigel胶预先包被的Transwell小室的上室，在小室下层添加500滋l含10%血清的培养液，放置在37益常规培养箱继续孵育48ho取出小室，用湿润的棉签擦去上层未穿过基底膜的细胞，用多聚甲醛固，结晶紫染，显微镜下观察并计数，实验重复3次，统计三组A549细胞穿膜细胞数目。
1.2.8Western blot检测使用细胞裂解液分别提取转染48h三组A549细胞总蛋白，采用BCA试剂盒对蛋白样品进行浓度测定并调平。配制10%的SDS-PAGE凝胶，取等量蛋白上样，电泳分离蛋白后转印到PVDF膜上。实验5%脱脂奶粉室温封阻2h，洗膜并加入相应一抗，根据说明书将PCNA和Ki-67一抗1:500稀释，Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9一抗1:600稀释,MMP-2和MMP-9一抗1:800稀
释,4益过夜孵育。第2天洗膜后再加入1：2000稀释的二抗，室温孵育1.5h，洗膜后滴加超敏ECL显液，在暗室显影曝光，采集图像，使用Quantity One软件分析蛋白条带灰度值，以茁-actin 为内参，实验重复3次。
1.3统计学分析使用统计学软件SPSS21.0对所得实验数据进行统计分析，计量数据以x±s表示，两组间差异比较采用t检验，多组间差异比较采用单因素方差分析，两两组间比较采用SNK-q检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。
2结果
2.1TMPO-AS1在肺癌细胞系中的表达qPCR结果显示，与人正常支气管上皮细胞系HBE比较，人肺癌细胞系A549、H1975、H1299和H1650中TMPO-AS1的表达水平显著升高（P<0.05）o见表1。在肺癌细胞系中A549细胞中TMPO-AS1的表达水平最高，因此后续实验选其为研究对象。
2.2TMPO-AS1对miR-204-3p表达的影响qPCR 结果显示，与si-NC组相比,si-TMPO-AS1组A549细胞TMPO-AS1的表达水平显著降低（P<0.05）, miR-204-3p的表达水平明显升高（P<0.05）；与Control组相比，si-NC组中TMPO-AS1和miR-204-3p的表达差异无统计学意义（P>0.05），见表2o 2.3TMPO-AS1靶向结合miR-204-3p生物信息学预测显示,TMPO-AS1与miR-204-3p序列存在连续结合位点，说明TMPO-AS1和miR-204-3p可能存在靶向关系。荧光素酶报告实验结果显示,TMPO-AS1能
够明显降低野生型miR-204-3p细胞的相对荧光素酶活性（P<0.05），对突变型miR-204-3p细胞的相对荧光素酶活性无明显影响（P>0.05）o见图1o
表1TMPO-AS1在HBE细胞系和不同肺癌细胞系中的表达（x±s,n=9）
Tab.1TMPO-AS1expression in HBE cell lines and different lung cancer cell lines（x±s,n=9）
Groups TMPO-AS1
HBE 1.00±0.09
A549 5.79±0.551)
H1975 4.62±0.451)2)
H1299 3.81±0.381)2)
H1650 2.94±0.301)2)
F328.603
P0.000
Note:Compared with HBE cell line,1)P<0.05；compared with A549cell line,2)P<0.05.
2.4沉默TMPO-AS1对A549细胞增殖能力的影响MTT实验结果显示，与si-NC组相比，si-TMPO-AS1组A549细胞活性显著降低(P<0.05)；与Control组相比,si-NC组A549细胞活性差异无统计学意义(P>0.05)o Western blot实验结果显示，与si-NC组相比，si-TMPO-AS1组A549细胞中增殖相关蛋白PCNA和Ki-67的表达显著下调(P< 0.05)；与Control组相比，si-NC组A549细胞中PCNA和Ki-67的表达差异无统计学意义(P> 0.05)o见图2和表3o
2.5沉默TMPO-AS1对A549细胞凋亡率的影响流式细胞术实验结果显示，与si-NC组相比,si-TMPO-AS1组A549细胞凋亡率明显升高(P< 0.05)；与Control组相比,si-NC组A549细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot实验结果显示，与si-NC组相比,si-TMPO-AS1组A549 细胞中凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3和Cleaved
表2三组A549细胞中TMPO-AS1和miR-204-3p的表达比较(x土=9)
Tab・2Comparison of TMPO-AS1and miR-204-3p expression in three groups of A549cells(x±s,n=9) Groups TMPO-AS1miR-204-3p
Control 1.00±0.10 1.00±0.09
si-NC0.99±0.090.96±0.09 si-TMPO-AS10.25±0.031) 3.42±0.351) F262.942381.175
P0.0000.000
Note:Compared with si-NC group,1)P<0.05.Caspase-9的表达显著上调(P<0.05)；与Control组相比,si-NC组A549细胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表达差异无统计学意义(P> 0.05)o见图3和表4o
2.6沉默TMPO-AS1对A549细胞侵袭能力的影响Transwell实验结果显示，与si-NC组相比，si-TMPO-AS1组A549细胞侵袭数目明显下降(P<0.05)；与Control组相比,si-NC组A549细胞侵袭数目差异无统计学意义(P>0.05)o Western blot实验结果显示，与si-NC组相比,si-TMPO-AS1组A549细胞中侵袭相关蛋白MMP-2和MMP-9的表达显著降低(P<0.05)；与Control 组相比，si-NC组A549细胞中MMP-2和MMP-9的表达差异无统计学意义(P>0.05)o见图4和表5所示。
■Control
图2Western blot检测三组A549细胞中PCNA和Ki-67蛋白的表达
Fig.2Western blot detection of PCNA and Ki-67protein expression in three groups of A549cells
Note:Compared with control,*.P<0.05.
A
IncRNATMPO-ASIT5*...UUGUCAAUCACUAGCCUUU UUUUCCCCAGC・3'
II I II III III III
has-miR-204-3p3'…UGCAG GGAAACGGAAGGGUCG5'
图1TMPO-AS1靶向miR-204-3p
Fig.1TMPO-AS1targets miR-204-3p
Note:A.Bioinformatics software predicts TMPO-AS1and miR-204-3p target binding schematic diagram； B.Luciferase report test to detect TMPO-AS1and miR-204-3p target relationship.Compared with NC group,*.P<0.05.表3三组A549细胞活性及PCNA和Ki-67的表达水平比较(x±s,n=9)
Tab.3Comparison of A549cell activity and PCNA and Ki-67expression levels in three groups(x±s,n=9)
Note:Compared with si-NC group,1)P<0.05.
Groups
Cell viability
(%)
PCNA Ki-67 Control100.00±4.710.70±0.070.38±0.04
si-NC96.52±4.620.71±0.070.37±0.04 si-TMPO-AS161.04±3.421)0.21±0.021)0.13±0.011) F227.247216.265163.909
P0.0000.0000.
000
Annexin V-FITC
B
Cleaved Caspase-3
Cleaved Caspase-9
p-actin
■ ■ ■
A
图3 沉默TMPO-AS1对A549细胞凋亡的影响
Fig. 3 Effect of silencing TMPO-AS1 on A549 cell apoptosis
Note ：A. Flow cytometry to detect the apoptosis rate of A549 cells in
three groups ； B. Western blot to detect the expression of Cleaved Caspase-3 and Cleaved Caspase-9 in three groups of A549
cells. Compared with control, *. P <0. 05.
表4 三组A549细胞凋亡率及Cleaved Caspase-3和
Cleaved Caspase-9 的表达水平比较(x ±s ,n = 9)
Tab. 4 A549 cell apoptosis rate and expression levels of Cleaved Caspase-3 and Cleaved Caspase-9 in three
groups (x ±s ,n = 9)
Note ：Compared with si-NC group,1 ) P <0. 05.Groups
Apoptosis rate( % ) Cleaved Caspase-3Cleaved Caspase-9
Control 3. 51±1.470. 11±0. 010. 20±0. 02si-NC
3. 61±1.500. 10±0. 010. 20±0. 02si-TMPO-AS1
26. 03±5. 111)0. 88±0. 091)
0. 72±0. 071)
F 148. 877
651. 361426. 947P
0. 000
0. 000
0. 000
3讨论
非小细胞肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一， 在男性中发病率更高，也是我国常见的恶性肿
瘤⑼。近来，尽管在非小细胞肺癌的临床方面 已经取得了很大的进步，但是患者的总生存时间并
没有显著改善，并且一个关键的问题是缺乏有价值
的生物分子标志物［10］。因此，迫切需要了解非小细
胞肺癌进展和转移的分子机制，以改善疾病发作时
的诊断和有效。lncRNA 作为一种非蛋白质的
转录本，通常被定义为长度超过200个核苷酸，最近
引起了越来越多学者的关注。越来越多的证据表 明,lncRNA 可能在多种癌症的生物学过程中发挥关 键作用，并作为包括预后生物标志物和潜在靶
标在内的许多临床应用的基础〔11-12］。最近有报道显 示,lncRNA 的异常表达可能与表观遗传学改变有 关，并参与了癌细胞的增殖和转移［13］。TMPO-AS1
作为TMPO 反义转录本1，广泛参与调控细胞的增
MMP-2
MMP-9
图4沉默TMPO-AS1对A549细胞侵袭能力的影响Fig. 4 Effect of silencing TMPO-AS1 on invasion a
bility
of A549 cells
Note ：A. Transwell test to detect the invasion ability of three groups of
A549 cells ；B. Western blot to detect the expression of MMP-2 and MMP-9 proteins in three groups of A549 cells.
表5三组A549细胞穿膜数目及MMP-2和MMP-9的表
达水平比较(x ±s ,n = 9)
Tab. 5 Comparison of number of membranes and
expression levels of MMP-2 and MMP-9 in three groups of A549 cells (x ±s ,n = 9)
Note : Compared with si-NC group , 1) P <0. 05.
Groups Number of transm embrane cells
MMP-2MMP-9Control 186. 75±15. 020. 44±0. 040. 48±0. 05si-NC
180. 44±14. 930. 42±0. 040. 49±0. 05si-TMPO-AS1
61.06±5.421)
0. 14±0. 011)
0. 19±0. 021)F
283. 338230. 182145. 167
P 0. 000
0. 000
0. 000
殖过程。目前有证据表明，TMPO-AS1在人类恶性
肿瘤的进展中发挥重要作用，且与患者预后不良密 切相关。如TMPO-AS1在前列腺癌中过度表达，能
够促进肿瘤的进展，且被认为是前列腺癌预后不良 的标志物［14］。本实验通过qPCR 检测发现,TMPO- AS1在人肺癌细胞系中的表达显著高于人正常支气
管上皮细胞系, 这提示 TMPO-AS1 可能在肺癌细胞
中发挥致癌基因的作用。选取TMPO-AS1表达量最
高的肺癌A549细胞为研究对象，通过转染TMPO-
AS1 siRNA 沉默其表达，结果发现，沉默TMPO-AS1
后A549细胞增殖和侵袭能力显著降低，增殖相关
蛋白PCNA 和Ki-67的表达明显下调，凋亡率明显
升高，凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9的表达明显上调，表明TMPO-AS1在肺癌
中发挥促癌的作用。这与以往QIN 等［⑸关于
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