柚皮素通过ROS/P38-MAPK信号通路调控肺癌A549细胞增殖及凋亡①
张悦姚宇梁玉灵王文军（西南医科大学附属医院呼吸与危重症医学科，泸州646000）
中图分类号R734.2R730.23文献标志码A文章编号1000-484X（2021）04-0448-06
［摘要］目的：探讨柚皮素调控A549细胞增殖及凋亡的分子机制。方法：培养A549细胞，通过CCK-8法检测不同浓度的柚皮素（0、30、60、90、120µmol/L）对A549细胞增殖的影响；流式细胞术检测各组细胞凋亡及ROS含量；WST-8法检测
SOD活性以及硫代酸法（TBA检测法）检测MDA含量；Western blot法检测Nrf2、NQO1和HO-1蛋白水平，检测P38MAPK 蛋白的磷酸化水平和caspase-3蛋白的活化水平。结果：柚皮素对A549细胞增殖具有较强的抑制作用（P<0.05），并呈浓度依赖性；与对照组相比，不同剂量柚皮素组A549细胞凋亡增加（P<0.001），显著升高ROS及MDA含量（P<0.05），抑制SOD活性（P< 0.05）；与对照组相比，Nrf2、NQO1和HO-1表达水平随着柚皮素剂量增加而显著降低，与对照组相比，P38MAPK蛋白的磷酸化水平和caspase-3蛋白的活化水平随着柚皮素剂量增加而显著升高（P<0.001），与90µmol/L、120µmol/L柚皮素组相比，抑制剂组P38MAPK蛋白的磷酸化水平和caspase-3蛋白活化水平降低（P<0.05）。结论：柚皮素对A549细胞具有增殖抑制作用和凋亡促进作用，作用机制可能与柚皮素激活ROS/P38-MAPK信号通路有关。
［关键词］细胞增殖；细胞凋亡；A549细胞；P38丝裂原活化蛋白激酶；柚皮素
Naringin regulates proliferation and apoptosis of lung cancer A549cells through ROS/p38-MAPK signaling pathway
ZHANG Yue，YAO Yu，LIANG Yu-Ling，WANG Wen-Jun.The Department of Respiratory Medicine，Affiliated Hospi⁃tal of Southwest Medical University，Luzhou646000，China
［Abstract］Objective：To investigate the molecular mechanism of naringin on proliferation and apoptosis of A549cells.Meth⁃ods：The effect of naringenin（0，30，60，90，120µmol/L）on the proliferation inhibition rate of A549cells were detected by CCK-8 method；apoptosis and ROS content were detected by flow cytometry；SOD activity was detected by WST-8method；MDA content was detected by thiobarbituric acid（TBA）method；Western blot was used to detect the protein levels of Nrf2，NQO1and HO-1，the phos⁃phorylation level of p38MAPK protein and the activation level of caspase-3protein.Results：Naringenin inhibited the proliferation of A549cells in a concentration dependent manner（P<0.05）；compared with the control group，the apoptosis of A549cells was increased in naringenin groups（P<0.001），the contents of ROS and MDA were significantly increased（P<0.05），and the activity of SOD was in⁃hibited（P<0.05）；compared wi
th the control group，the expression levels of Nrf2，NQO1and HO-1decreased significantly with the in⁃crease of naringenin dose.Compared with the control group，the phosphorylation level of p38MAPK protein and the activation level of caspase-3protein were significantly increased with the increase of naringenin dose（P<0.001）.Compared with90µmol/L and 120µmol/L naringenin group，the phosphorylation level of p38MAPK protein and the activation level of caspase-3protein in inhibitor group were significantly increased（P<0.001）.Caspase-3protein activation level decreased（P<0.05）.Conclusion：Naringenin can in⁃hibit proliferation and promote apoptosis of A549cells，which may be related to the activation of ROS/p38-MAPK signaling pathway.
［Key words］Cell proliferation；Apoptosis；A549cell；P38mitogen activated protein kinase；Naringin
肺癌是目前发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，是癌症死亡的首要原因［1］。虽然目前肺癌有多种手段，但肺癌的5年总体生存率仍很低，选择手术、放化疗、靶向等常规方法的患者预期生存率依旧差强人意［2］。目前研究表明，由于细胞增殖与凋亡的平衡被扰乱而导致肿瘤的形成，细胞过度增殖的重要原因是细胞凋亡受阻，细胞凋亡在许多疾病的正常发展和病理过程中起着至关重要的作用，凋亡的研究对肿瘤的防治有重要意义［3］。抗肿瘤药物可通过促进肿瘤细胞凋亡进而抑制肿瘤恶化进展，同时还可影响肿瘤细胞放疗敏感性［4］。虽然化疗是目前临床上肺癌的常用手段，
但因
doi：10.3969/j.issn.1000-484X.2021.04.013
①本文受中国宋庆龄基金会呼吸疾病临床研究公益基金资助（No.2018MZFT-160）。
作者简介：张悦，女，在读硕士，主要从事肺癌相关的研究，E⁃mail：458829832@qq。
通信作者及指导教师：王文军，男，硕士，教授，硕士生导师，主要从事肺
癌相关的研究，E⁃mail：438085505@qq。
其可产生耐药性和毒副作用［5］，导致多数患者无法完成有效的放化疗周期，所以应致力于研究新的预防和肺癌的天然药物［6］。研究表明，如紫杉醇等天然药物对于抗肿瘤的有着很好的疗效，所以，寻新型抗肿瘤的天然药物意义重大［7］。柚皮素是天然柑橘类水果中最丰富的类黄酮之一，具有抑制乳腺癌、结肠癌、胃癌和前列腺癌细胞生长的能力［8］。但是，目前柚皮素对肺癌细胞增殖及凋亡的相关研究较少，其调控机制尚不十分清楚，本研究旨在探讨柚皮素对A549细胞增殖及凋亡的影响，阐明其影响的可能机制，为柚皮素在临床上预防及肺癌提供证据，现报道如下。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞及试剂A549细胞来源于西南医科大学中心实验室；；柚皮素（货号HY-N0100）、p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂SB203580（SB）（货号HY-
10256）购自MCE；胎牛血清（FBS）（货号141215）购自杭州天杭生物科技有限公司，DMEM高糖培养基（货号SH30022）购自HyClone；总超氧化物歧化酶（T-SOD）测试盒（羟胺法）（货号A001-1-1）、丙二醛（MDA）测定试剂盒（TBA法）（货号A003-1）购自南京建成；CCK-8试剂盒（货号C0038）、Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒（货号AO2001-02P-G）购自天津三箭生物技术有限公司；活性氧（ROS）检测试剂盒（货号S0033）购自Beyotime，GADPH（货号ab37168）、Nrf2（货号#12721）、HO-1（货号10701-0-AP）、NQO1（货号ab80588）、P-P38（货号#4511）、P38（货号#8690）、Cleaved capase3（货号ab49822）购自Abcam；HRP-Goat anti Rabbit（货号AS1107）购自ASPEN；RIPA总蛋白裂解液（货号AS1004）、BCA蛋白质浓度测定试剂盒（货号AS1086）、ECL化学发光检测试剂盒（货号AS1059）购自ASPEN。
1.1.2主要仪器CO2恒温培养箱购自SHEL LAB，倒置显微镜购自OLYMPUS；酶标检测仪购自Diatek；流式细胞仪购自BD；离心机购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；电泳仪购自北京市六一仪器厂。
1.2方法
1.2.1细胞培养将A549细胞置于含10%FBS的RPMI1640培养液中，孵育于37℃、5%CO2的培养箱，当细胞已长满培养瓶时，将培养瓶从培养箱中取出，用PBS洗涤2次。
1.2.2CCK-8法将细胞用胰蛋白酶消化，以10000个/孔接种于96孔板中，孵育于37℃下CO2（5％）培养箱中24h以贴壁，继续培养24h后分别更换为100µl细胞样品分别对应的含有柚皮素（30、60、90、120µmol/L）的培养基，对照组更换为含溶剂的培养基，在每孔中加入10µl CCK-8溶液孵育2h 后使用酶标仪测定450nm光吸收值以测定细胞活力。细胞存活率%=（实验组-空白组）/（对照组-空白组）×100%。
1.2.3流式细胞术取对数生长期的A549细胞，在6孔板中培养，分别用（0、30、60、90、120µmol/L）柚皮素处理48h后，再收集各组培养液于流式管中，用PBS洗涤1遍，然后加入胰酶消化细胞后再加入培养基终止消化；再收集各组细胞于上一步的流式管中，300g离心5min，弃去上清后加入1ml PBS 重新悬浮细胞，再300g离心5min，弃去上清，沉淀用300µl的Binding Buffer重悬，按照试剂盒操作说明检测细胞凋亡，采用流式细胞仪获得分析结果，实验重复3次。
细胞分组同上，按照1∶1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10µmol/L。用PBS洗3遍，加入1ml稀释好的DCFH-DA，37℃孵育20min，充分去除未进入细胞内的DCFH-DA后，再加入1ml HG培养基，显微镜下观察拍照或流式上机以检测ROS含量。
1.2.4WST-8法、TBA法细胞分组同上，用旋涡混匀器充分混匀，置于37℃恒温水浴40min，于波长550nm处，1cm光径比，测各管吸光度值以检测SOD活性；用旋涡混匀器充分混匀，95℃沸水水浴40min，取出后流水冷却，按3500～4000r/min，离心10min，于波长523nm处测各管吸光度值以检测MDA含量，实验重复3次。
1.2.5Western blot法取对数生长期的A549细胞，分别用（0、30、60、90、120µmol/L）柚皮素以及柚皮素120µmol/L+SB（10µmol/L）处理48h后，收集各组细胞，用细胞总蛋白提取试剂（RIPA）裂解各组细胞提取总蛋白，使用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定样品蛋白浓度；将转好的膜加入封闭液，室温封闭1h后，除去封闭液，加入用一抗稀释液稀释好的一抗4℃过夜，回收已稀释的一抗，用TBST洗3次，每次5min加入二抗稀释液稀释好的二抗，室温孵育30min，用TBST在室温下摇床上洗4次，每次5min，然后化学发光检测，使用AlphaEaseFC软件处理系统分析目标带的光密度值。
1.3统计学处理所有资料采用SPSS2
2.0软件对实验数据进行分析，所得到的数值以xˉ±s表示，多样本均数间比较采用单因素方差分析，其中两两比较采用LSD-t法，检验水准α=0.05。
2结果
2.1CCK-8法检测结果与对照组相比，柚皮素组可抑制A549细胞增殖，且随浓度增加，增殖抑制作用更明显（P<0.05），方差分析显示5组的存活率差异具有统计学意义（F=70.782，P<0.001），见图1、表1。
2.2流式细胞仪检测结果与对照组相比，随着柚皮素浓度增加，A549细胞凋亡逐渐增加（P< 0.001），方差分析显示5组差异具有统计学意义（P
<
图2不同浓度的柚皮素对A549的细胞凋亡的影响
Fig.2Effect of Nar on apoptosis of A549cells
Note：Compared with control group，*.P<0.001；compared with30µmol/L
Nar，#.P<0.05；compared with90µmol/L Nar，△.P
<0.05.
图1不同浓度的柚皮素对A549的细胞增殖的影响
Fig.1Effect of Nar at different concentrations on prolif⁃
eration of A549cells
Note：Compared with control group，*.P<0.05；compared with
30µmol/L Nar，#.P=0.010；compared with60µmol/L Nar，△.
P<0.001；compared with90µmol/L Nar，▲.P=0.001.
表1不同浓度柚皮素作用下细胞活力的比较（xˉ±s，%）
Tab.1Comparison of cell viability under different con⁃
centrations of Nar（xˉ±s，%）
Groups
Control
30µmol/L Nar
60µmol/L Nar
90µmol/L Nar
120µmol/L Nar
F value
n
3
3
3
3
3
Cell viability
100.00±0.000
95.262±0.4781）
89.855±0.4981）2）
79.402±0.8061）3）
70.264±0.7471）4）
70.782
Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with
30µmol/L Nar，2）P=0.010；compared with60µmol/L Nar，3）
P<0.001；compared with90µmol/L Nar，4）P=0.
001.
图3柚皮素对A549细胞中ROS含量的影响
Fig.3Effect of Nar on ROS level in A549cell s
Note:Compared with control group，*.P<0.001；compared with30µmol/L
Nar，#.P<0.001；compared with90µmol/L Nar，△.P<0.001.
0.001），见图2。与对照组相比，不同浓度柚皮素组MFI的表达升高（P<0.001），且随柚皮素浓度增加，MFI呈明显升高趋势，方差分析显示5组差异具有统计学意义（F=178.220，P<0.001），见图3。
2.3WST-8法、TBA法结果与对照组相比，不同浓度柚皮素组SOD活性均下降（P<0.05），且随柚皮素浓度增加，SOD活性呈明显下降趋势，方差分析5组差异具有统计学意义（F=76.847，P=0.000），与对照组相比，不同浓度柚皮素组MDA含量均升高（P< 0.05），且随柚皮素浓度增加，MDA含量呈现明显升高趋势，方差分析显示5组差异具有统计学意义（F= 50.589，P=0.000），见图4、5。
2.4Western blot检测结果
2.4.1实验结果显示，与对照组相比，柚皮素组Nrf2、NQO1和HO-1表达水平随着柚皮素浓度（30、60、90、120µmol/L）的增加而显著降低，方差分析显示5组差异具有统计学意义（F值分别为55.063、9
3.609、192.155，P<0.001），见图6。
2.4.2与对照组比较，柚皮素组P38MAPK蛋白的磷酸化水平以及caspase-3蛋白的活化水平随着柚皮素浓度（30、60、90、120µmol/L）的增加而显著升高，方差分析5组差异具有统计学意义（F=108.073，P<0.001），两两比较显示，与90µmol/L、120µmol/L 柚皮素组相比，抑制剂组P38MAPK蛋白的磷酸化水平和caspase-3蛋白活化水平降低（P<0.05），与
30µmol/L、60µmol/L柚皮素组相比，差异无统计学意义（P>0.05），见图7
。
图4柚皮素对A549细胞中SOD活性的影响
Fig.4Effect of Nar on SOD acitivity in A549cells
Note：Compared with control group，*.P<0.05；compared with
30µmol/L Nar，#.P=0.005；compared with60µmol/L Nar；△.
P<0.001；compared with90µmol/L Nar，▲.P=0.
004.
图5柚皮素对A549细胞中MDA含量的影响
Fig.5Effects of Nar on MDA content in A549cells
Note：Compared with control group，*.P<0.05；compared with30µmol/L
Nar，#.P=0.036；compared with60µmol/L Nar，△.P=0.007；
compared with90µmol/L Nar，▲.P=0.
001.
图6不同浓度的柚皮素对A549细胞中Nrf2、NQO1和
HO-1蛋白表达的影响
Fig.6Effects of Nar of different concentrations on expres⁃
sion of Nrf2，NQO1and HO-1in A549cells
proliferationNote：A.Control group；B.30µmol/L Nar；C.60µmol/L Nar；D.90µmol/L
Nar；E.120µmol/L Nar.Compared with control group，*.P<0.05；
compared with30µmol/L Nar，#.P<0.05；compared with60µmol/L
Nar，△.P<0.05；compared with90µmol/L Nar，▲.P<0.05；com⁃
pared with60µmol/L Nar，☆.P
<0.05.
图7不同浓度柚皮素对P-P38MAPK蛋白和caspase-3蛋
白表达的影响
Fig.7Effect of Nar in different concentrations on expres⁃
sion of p-p38MAPK and caspase-3protein
Note：1.Control group；2.30µmol/L Nar；3.60µmol/L Nar；4.90µmol/L
Nar；5.20µmol/L Nar；6.Inhibitor group.Compared with control
group，*.P<0.001；compared with inhibitor group，#.P<0.05.
3讨论
柚皮素是黄酮类化合物家族的一员，富含于柑橘类水果和西红柿，具有多种预防性特性［9］。已有研究表明，柚皮素在体内外对细胞有多种有益的作用，如抗病毒、抗癌、抗炎和心脏保护等［10］。最近研究发现，黄酮类化合物及其代谢物可发挥细胞内作用，包括直接调节细胞信号通路，包括丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联反应［11］。研究发现，柚皮素可通过抑制PI3K/AKT通路中
PI3K活性、降低含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（caspase）-31的活性来促进乳腺癌的凋亡，阻断细胞周期并调节
AKT及NF-κB信号通路抑制乳腺癌细胞的增殖［12］。临床上，随着柚皮素摄入量的增加，癌症的总发病率显著降低［13］。本研究显示，柚皮素可呈浓度依赖性的抑制A549细胞增殖，并促使其凋亡。
研究表明，细胞膜脂质过氧化是高活性氧引起的主要氧化反应之一，导致丙二醛（MDA）的产生，活性氧（ROS）的产生与MDA水平的升高明显相关，超氧化物歧化酶（SOD）是一种重要的抗氧化酶，其活性反映了其清除氧自由基的能力［14-15］；本研究显示，柚皮素可使A549细胞中SOD活性降低，同时使A549细胞中ROS、MDA的含量升高，且均呈浓度依赖性，因此可能是由于A549细胞对ROS的清除能力下降，进而导致细胞氧化应激损伤，这显示柚皮素促使细胞凋亡的机制可能是氧化应激反应。ROS 负责JNK和p38通路的激活，从而导致细胞中其他促凋亡分子水平的升高［16］。本研究探讨了柚皮素是否可以诱导细胞内ROS的生成，并检测了细胞内ROS的水平，结果显示，柚皮素可以升高细胞内ROS 水平，并呈浓度依赖性，并且可促使A549细胞发生凋亡。
p38丝裂原活化蛋白激酶（P38MAPK）是哺乳动物的MAPKs之一，在肿瘤的发生发展中起着关键作用，可调节细胞增殖、分化、凋亡等［17-18］。研究表明，MAPKs可以调节Nrf2的激活和HO-1基因的表达［19］。Nrf2是一种碱性亮氨酸拉链基因子集，通过结合抗氧化反应元件（ARE），激活靶基
因表达，如HO-1、NQO1、SOD，在抗氧化应激中起重要作用［20-21］。HO-1主要受Nrf2调控，是由Nrf2向细胞核的转移及其与HO-1启动子的相互作用［22］。NQO1可以防止氧化应激，通常，NQO1表达较低，然而在氧化应激的情况下，细胞保护是通过激活ROS信号通路，导致多种下游因子的上调，包括NQO1，因此，NQO1是作为系统细胞氧化还原状态的重要标志［23］。本研究表明，柚皮素可浓度依赖地下调Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表达水平，这表明柚皮素可能通过P38MAPK通路诱导A549细胞发生氧化应激反应。
ROS可通过激活MAPK激酶和抑制MAPK磷酸酶等多种途径导致p38MAPK的持续活化［24］，例如，研究显示，紫草素可导致细胞内ROS的积累增加，导致线粒体膜电位损失、氧化损伤以及JNK和P38 MAPK通路的激活，进而导致A549细胞凋亡，呋喃酮可通过ROS介导的JNK和P38MAPK通路激活，诱导结直肠癌细胞凋亡［25］。SHIN［26］显示，p38 MAPK抑制剂SB可阻断ROS引发的A549细胞凋亡。本研究发现柚皮素能显著提高（p）-p38MAPK 水平，激活p38MAPK信号通路，活化A549细胞中p38MAPK和caspase-3，浓度依赖地下调Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表达水平，因此，柚皮素可能通过增加磷酸化（p）-p38MAPK的表达诱导A549细胞凋亡。此外，SB可抑制该信号通路传导途径，显著降低柚皮素诱导的A549细胞的Nrf2、NQO1和HO-1表达水平，也证明了Nrf2、NQO1和HO-1受p38 MAPK信号通路的调控，提示柚皮素可能通过ROS/ p38MAPK通路诱导A549细胞发生凋亡。
综上所述，本研究探讨了柚皮素可对A549细胞产生增殖抑制作用和凋亡促进作用，并呈浓度依赖性，
主要作用机制可能与其抑制了SOD的活性，导致细胞内ROS、MDA的含量升高，并下调相关蛋白的表达，从而与激活p38MAPK信号通路相关。
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