MTS promega 说明书
普洛麦格(北京)生物技术有限公司
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CellTiter 96? AQ ueous One Solution
Cell Proliferation Assay
I. 描述 (1)
II. 产品组分和保存条件 (4)
III. 操作步骤 (5)
A. 一般操作步骤 (5)
B. 应用举例：用B9细胞检测IL-6生物活性的操作程序 (5)
IV. 通常需考虑的因素 (6)
A. 背景吸光度值 (6)
B. 读取数据的可选波长 (6)
C. 淋巴细胞检测 (7)
D. 试剂优化 (7)
E. 细胞数的优化 (7)
V. 相关产品 (8)
VI. 参考文献 (11)
I. 描述
CellTiter 96? AQ ueous One Solution Cell Proliferation Assay(a)是一种用比法来检测细胞增殖和细胞毒实验中的活细胞数量的检测试剂。此试剂含有一个新型的四唑化合物
[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, inner salt; MTS(a)]和一种电子偶联剂(phenazine ethosulfate; PES)。PES具有增强的化学稳定性，这使它可与MTS混合形成稳定的溶液。这种方便的“单溶液”模式，是在第一代CellTiter 96?AQ ueous Assay的基础上的改进，CellTiter 96?AQueous Assay中使用的电子偶联剂PMS与MTS溶液是分开提供的。
proliferationMTS (Owen’s reagent) 被细胞生物还原成为一种有的甲臜产物，可直接溶解于培养基中(图1, 1)。这种转化很可能是在代谢活跃的细胞中的脱氢酶产生的NADPH或NADH的作用下完成的(2)。检测时，只?
然后以酶标仪读取490nm的吸光度值(3,4)。
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图1. MTS四唑盐和其甲臜产物的结构。
在490nm处检测到的甲臜产物的量与培养中的活细胞数成正比(图2)。由于MTS的甲臜产物在组织培养基中可溶，CellTiter 96? AQueous One Solution Assay与MTT或INT法相比操作步骤更少(5,6)。MTT还原反应的甲臜产物是一种结晶沉淀，在检测（570nm）前需要额外的步骤来溶解这种结晶(7)。
如果您目前在使用[3H]胸腺嘧啶掺入法，那么可以在通常需加入放射性胸腺嘧啶的时间点用CellTiter 96? AQ ueous One Solution Reagent 来替代[3H]胸腺嘧啶。通过检测数据已证明基于MTS法的CellTiter 96?AQueous Assay 和基于MTT法的CellTiter 96? Assay能够替代[3H]胸腺嘧啶法(4,7)。
CellTiter 96? AQ ueous One Solution Assay的优点:
? 使用简单: 把试剂加入到细胞中, 孵育，检测。
? 方便: 过滤灭菌的单一溶液, 即用型试剂。
? 快速: 可直接在96孔板中进行检测，无需洗涤或富集细胞。也去掉了MTT检测过程中必须
的溶解步骤。? 无放射性: 无需液闪溶液或放射性废物的处理。
? 灵活: 检测板被检测后可重新进行孵育，以进一步显。
? 安全: 无需挥发性有机溶剂来溶解甲臜产物(与MTT不同)。
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图2. 使用CellTiter 96? AQueous One Solution Assay在490nm处检测细胞数对吸光值的影响。在加有RPMI的96孔板中加入不同数量的B9杂瘤细胞，RPMI中含有50uM的2-巯基乙醇，5% FBS和2ng/ml IL-6。培养基平衡1小时后,加入20μl/孔CellTiter 96?AQueous One Solution Reagent。在37°C，5%CO2浓度的细胞培养箱中孵育1小时,然后使用酶标仪检测490nm 的吸光度值。每个数据点表示4个重复孔的均值±标准差，相关系数为0.993, 说明细胞数和吸光度值呈很好的线性相关性。背景吸光度值（对应0细胞/孔）没有从数据中减去。
II. 产品组分和保存条件
3 产品规格目录号
200 assays G3582 CellTiter 96? AQueous One Solution
Cell Proliferation Assay
只用于实验室研究。包括:
? 4ml CellTiter 96? AQueous One Solution Reagent
? 1 产品说明书
产品规格目录号
1,000 assays G3580 CellTiter 96? AQueous One Solution
Cell Proliferation Assay
只用于实验室研究。包括:
? 20ml CellTiter 96? AQueous One Solution Reagent
? 1 产品说明书
产品规格目录号CellTiter 96? AQueous One Solution
5,000 assays G3581 Cell Proliferation Assay
只用于实验室研究。包括:
? 100ml CellTiter 96? AQueous One Solution Reagent
? 1 产品说明书
储存条件:长期储存,–20°C避光保存。产品有效期请参见产品信息标签。频繁使用,4°C避光
保存至6周。注意：实验证明此试剂冻融10次后与新鲜的试剂使用效果相同。
安全性:就我们所知，此物质的化学、物理和毒理学性质还未完全研究清楚；因此，我们建议您在使用此试剂时，带手套，穿实验服并带护目镜。
光敏感性: CellTiter 96? AQueous One Solution Reagent是一种光敏感的试剂，装在琥珀的容器中。试剂暴露在光线下数小时后可能会发生褪。这种褪反应可能会导致490nm的背景吸光值轻微升高，但不会影响检测结果。
III操作步骤
4 用户提供：
? 96孔组织培养板
? 多道加样器（排），或连续式加样器，或数字式加样器
? 酶标仪
III.A.一般操作步骤
1. 融化CellTiter 96? AQueous One Solution Reagent。室温静止90分钟或37°C 水浴10分钟，应该可以完全溶解20ml的CellTiter 96? AQueous One Solution Reagent。
2. 在96孔板中，每孔100ul培养基加20μl CellTiter 96? AQueous One Solution Reagent。
注: 推荐以排或连续式加样器及数字式加样器加试剂，以保证加样方便准确。
3. 在37°C，5% CO2的环境下孵育1-4个小时。
注:如果立刻检测就直接进行第4步，如果需要以后检测，每孔加入25ul 10% SDS终止反应，避光保存于室温的湿盒中，最多可保存18小时。然后再进行第4步。
4. 490nm读取吸光度值。
III.B. 应用举例：用B9细胞检测IL-6 生物活性的操作程序
1. B9细胞在含有5% FBS, 50μM 2-巯基乙醇 (2-ME)和5ng/ml的重组IL-6的培养基中培养，每3天或当细胞浓度达到2 × 105 cells/ml时，以2 × 104细胞/m的l细胞浓度传代培养细胞，并以IL-6继续处理。
注: 用于生物检测的B9细胞应该在最后一次传代培养后的2天(以IL-6处理)。
2. 加50μl/孔的IL-6样品或标准品进行检测，以含有5% FBS和50μM 2-ME的RPMI 1640稀释。IL-6的标准液的初始滴定浓度4ng/ml在第12列，进行两倍系列稀释至列2(至4pg/ml)。(在下面的第5步加入细胞悬液后，滴定标准的终浓度将会变为从12列的2ng/ml到第2列的2pg/ml)。使用列1作为阴性对照：加入无IL-6的RPMI 1640培养基(和附加成分)。在37°C，5% CO2的湿箱中平衡平板，同时收集细胞用于实验。
3. 在含有5% FBS和50μM 2-ME的RPMI 1640中离心300 × g，5 min洗两遍细胞。
4. 确定细胞数和细胞活力(通过台盼蓝染法),以含有5% FBS和50μM 2-ME的RPMI 1640重悬细胞至1 × 105细胞/ml的终浓度。
5. 每孔加50μl细胞重悬液(5,000个细胞)至第2步准备好的平板中。现在每孔总体积应为100μl。
6. 将平板在37°C，5% CO2的细胞培养箱中孵育48–72小时。
7. 每孔加20μl CellTiter 96? AQueous One Solution Reagent。
8. 在37°C，5% CO2的细胞培养箱中孵育1–4小时。
注:如果立刻检测就直接进行第9步，如果需要以后检测，每孔加入25ul 10% SDS终止反应，避光保存于
5 室温的湿盒中，最多可保存18小时。然后再进行第9步。
9. 490nm读取吸光度值。
10. 绘制曲线：经校正的吸光值在Y轴，生长因子浓度在X轴。确定最大吸光值（峰值）和最小吸光值（无生长因子对照）差值的一半所对应的X轴值；该值即为ED50值(ED50 =产生半数最大反应的所必需的生长因子浓度)。
IV. 通常需考虑的因素
IV.A. 背景吸光度
在以CellTiter 96? AQueous One Solution Reagent孵育后，细胞培养基中会在490nm有微量的自发产生的吸收光。使用的细胞培养基种类，血清种类，pH和暴露在光线下的时间长度都可能会影响490nm 的背景吸光度值。孵育4小时后，背景吸光度值通常在0.2–0.3吸光单位。背景吸光度可能受某些带四唑还原反应的化合物的影响。强还原物质，包括维生素C,或含巯基的化合物, 如谷胱甘肽，辅酶A和二硫苏糖醇, 能够以非酶的方式还原四唑盐，从而导致背景吸光值的增加。高pH的培养基或长时间暴露在直接光照下面也可能导致自发的四唑盐还原反应的加速进而导致背景吸光值的增加。如果使用含酚红的培养基，快速的颜变化可能指示待测化合物引起的pH值变化。
待测化合物产生的特异的化学干扰可以通过检测对照孔(含有不同浓度待测化合物的培养基，但是不含细胞)的吸光度来确定。
490nm的背景吸光度值可用下述方法校正: 准备3个重复的对照孔(无细胞)，含有与实验孔同样体积的细胞培养基和CellTiter 96? AQueous One Solution Reagent。从所有其它孔的吸光值中减去”无细胞”对照孔在490nm的吸光度平均值，即可得到校正的吸光度值。
IV.B. 读取数据的可选波长
图3. 显示MTS还原后产生的甲臜产物的吸光度光谱。我们推荐在吸收峰490nm读取数据; 但是如果您的酶标仪没有490nm的滤片,可以在450–540nm范围内读取数据。如果需要，可以在其它波长读取吸光度值，但是检测灵敏度会降低。在630–700nm范围的参考波长可以用来减去细胞碎片过多造成的背景值,以及其它非特异性吸光度值。
图 3. MTS/甲臜吸光度光谱。MTS四唑化合物还原后产生的甲臜产物的吸光度光谱在490nm显示最大吸光值。负吸光值（382nm）对应的是MTS的消失（转化成甲臜产物）。
IV.C. 淋巴细胞检测
淋巴细胞产生的甲臜比其它类型的细胞要少(8)。为了得到更显著的吸光度值变化，需增加细胞数至约2.5–10 × 104细胞/孔，并在加入CellTiter 96? AQ ueous One Solution Reagent后孵育培养板至最长的4小时。
IV.D.试剂优化
四唑盐和电子偶联剂的浓度已经通过多种常用细胞系（100ul培养基，在96孔板中培养）进行了优化。如果使用不同体积的培养基,可以根据20μl 试剂/100μl 培养基的比例调整。这个试剂:培养基比值产生的MTS终浓度为317μg/ml /实验孔。对于不同的细胞系，最适的四唑
盐和电子偶联剂的浓度可能会有微小的变化；尽管如此, 使用CellTiter 96? AQ ueous One Solution Reagent配方的试剂，检测灵敏度很少受到影响。如果试剂优化对你的实验至关重要，我们推荐使用 CellTiter 96? AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Cat.# G5421, G5430, G5440)或 CellTiter 96? AQueous MTS Reagent Powder (Cat.# G1111, G1112) ，这些试剂化合物是分开提供的。
IV.E. 细胞数的优化
细胞增殖研究需要细胞在一段时间内生长。因此应选择合适的起始细胞数使其产生的检测信号接近检测线性范围的低端。这样有助于保证在实验终点检测到的信号不会超过检测的线性范围。可以参考图2的实验来确定细胞数。
不同类型的细胞，代谢活性不同。影响细胞代谢的因素也会影响细胞数和吸光值的关系。黏附依赖性细胞在高细胞密度时会产生接触抑制，进而代谢活性降低，导致细胞数和吸光度值的非线性关系。影响细胞质体积或细胞生理状态的因素也会影响代谢活性。
对大多数肿瘤细胞，杂瘤细胞和纤维母细胞系,推荐5,000 cells/孔作为增殖研究的起始细胞数，虽然少
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