第59卷第2期Vol.59 No.2
山东大学学报（医学版）
JOURNAL OF SHANDONG UNIVERSITY( HEALTH SCIENCES)
2021年2月
Feb. 2021
文章编号：167 丨-7554 (2021)02-0001-06 DOI ： 10.6040/j.issn. 1671 -7554.0.2020.0934 .基础医学.
胶质瘤细胞与血管内皮细胞的信号
Crosstalk对肿瘤细胞增殖和侵袭的影响
顾金海1，路宁2，顾珈榕3，文玉军1，强媛媛1，和祯泉1，
杨勇、王峰’，孙涛'，牛建国1
(1.宁夏医科大学宁夏颅脑疾病重点实验室，宁夏银川750004; 2.银川市第一人民医院神经外科，宁夏银川750001;
3.宁波大学医学院预防医学学科系，浙江宁波315211)
摘要：日的探讨胶质瘤细抱与血管内皮细胞之间的信号Crosstalk及其对肿瘤细胞增殖和侵袭的影响
方法将人脑微血管内皮细胞（HBMEC)分4组培养：对照组为HBMEC常规培养，血管内皮生长因子（VEGF)组 为HBMEC在含VEGFIM(50ng/mL)的内皮细胞培养基（ECM)中培养，U87MG共培养组为HBMEC与肢质瘤细胞U87MG共培养，U251共培养组为HBMEC与胶质瘤细胞U251共培养，然后采用ELISA检测胶质瘤细胞及组织因予VEGF对血管内皮细胞分泌CXCL8的影响将人脑胶质瘤细胞U87MG或U251分4组培养：对照组为 U87MG或U25丨常规培养，U87MG/U25丨+HBMEC组为U87MG或U251与HBMEC共培养，U87MG/U25I + HBMEC+rhCXCL8 组为U87MG 或 U251 与HBMEC 在含 Akt 通路的激动剂rhCXCL8(50 ng/mL)的DMEM 中共 培养，U87MG/U25I+HBMEC+ LY294002 组为U87MG 或U251 与HBMEC 在含Akt 通路的抑制剂LY294002
(I jxmol/L)的DMEM中共培养，分别采用Western blotting、CCK-8、Transwe丨丨侵袭实验检测血管内皮细胞及其分
proliferation泌CXCL8对胶质瘤细胞的增殖、侵袭以及Akt蛋白表达的影响.结果与对照组比较，VEGF组、U87MG共培养 组、U251共培养组中HBMEC培养体系的CXCL8分泌量升高（尸<0.05)，肢质瘤细胞及其分泌VEGF可促进血管
内皮细胞分泌CXCL8 与对照组比较，U87MG/U251 +HBMEC组细胞P-Akt蛋白表达增高（P<0.05)，增殖及侵袭能力增高（/^O.OS)；给予CXCL8激活使P-Akt蛋白表达、增殖及侵袭进一步升高（P<0.01 )；给予LY294002抑 制则P-Akt的表达降低（P<0.0l)，血管内皮细胞可通过分泌CXCL8激活股质瘤细胞Akt信号通路，并促进其增殖和侵袭结■i t e■胶质瘤细胞与血管内皮细胞之间存在VEGF-CXCL8-Akt信号Crosstalk机制，在胶质瘤增殖和侵袭中发挥重要作用.
关键词：肢质瘤；血管内皮细胞;Crosstalk；血管内皮生长因子；CXCL8; Akt
中图分类号：R730.264 文献标志码:A
m
Effects of signal Crosstalk between glioma cells and vascular endothelial cells on the proliferation and invasion of glioma cells GU Jinhai1, LU Ning2, GU Jiarong3, WEN Yujun1, QIANG Yuanyuan1, HE Zhenquan',
YANG Y o n g', WANG Feng1, SUN Tao1, NIU Jianguo'
(1. Ningxia Key Laboratory of Cerebrocranial Diseases, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia, China；
2. Department of Neurosurgery, The First People's Hospital of Yinchuan, Yinchuan 750001, Ningxia, China；
3. Department of Preventive Medicine, Medical School of Ningbo University, Ningbo 315211. Zhejiang, China)
A bstract：Objective To explore the signal Crosstalk between glioma cells and human brain microvascular endothelial
cells (HBMECs) and its effects on the proliferation and invasion of glioma cells. Methods HBMECs were divided into four groups：the control group was cultured with conventional endothelial cell medium (ECM) ；the vascular endo-
收稿日期:2020-06-10；网络出版时间:2021-01-25 14:19:42
网络出版地址：http: //kns. cnki. net/kcms/detai1/37.1390. R•202 丨 0 丨 25 •0940.002 • html
基金项目：国家自然科学基金（8丨丨603丨2)；宁夏自然科学基金（2020六八0)3152)；银川市医疗卫生领域科技项目（2020-5[-012)；宁夏重点研发计划（对外科技合作专项，2019BFH0203)
通信作者：牛建国：E-mail:***************
2山东大学学报（医学版)59卷2期
thelial growth factor ( VEGF) group was cultured with ECM treated with VEGF165( 50 ng/m L) ；U87MG co-culture group was co-cultured with U87MG cells；U251 co-culture group was co-cultured with U251 cells. Then E1ISA was performed to detect the effects of glioma cells and VEGF on the secretion of CXCL8. The glioma cells (U87MG/U251) were divided into four groups：the control group was cultured with conventional DMEM；U87MG/U251 + HBMEC group was co-cultured with HBMECs, U87MG/U251+HBMEC + rhCXCL8 group was co-cultured with HBMECs in DMEM containing rhCXCL8 (50 ng/m L, Akt pathway agonist), U87MG/U251 + HBMEC + LY29400 group were
co-cultured with HBMECs in DMEM containing LY294002 ( 1p.mol/L, Akt pathway inhibitor). Then Western blotting, CCK-8 and Transwell assays were performed to examine the effects of HBMECs and secretion of CXCL8 on the proliferation and invasion of glioma cells and expression of Akt. Results The secretion of CXCL8 in the VEGF group,
U87MG co-culture group and U251 co-culture group were significantly increased compared with that in the control group (^<0.05) , which indicated that glioma cells and VEGF could promote the secretio
n of CXCL8. Compared with the control group, the U87MG/U251+HBMEC group had elevated P-Akt, proliferation and invasion (尸<0.05) ; exposure
to CXCL8 further increased P-Akt, proliferation and invasion (尸<0.01), whereas exposure to LY294002 suppressed
P-Akt (P<0.01), which indicated that HBMECs could activate Akt signaling pathway by secreting CXCL8, and promote the proliferation and invasion of glioma cells. Conclusion There is a crosstalk of VEGF-CXCL8-Akt signal network between glioma cells and HBMECs, which might play an important role in the proliferation and invasion of glioma cells.
Key words：Glioma；Human brain microvascular endothelial cells；Crosstalk；Vascular endothelial growth factor；CXCL8；Akt
胶质瘤是中枢神经系统最为常见的原发性肿 瘤，目前效果不佳。研究结果表明，恶性胶质瘤 患者的中位生存期仅为12~ 15个月m。胶质瘤的 发病是一个多因素参与、多基因改变、多步骤演进的 复杂过程，也是肿瘤细胞与周围微环境中的各种相 关因素相互影响、相互作用的结果。这种相互作用 不仅表现为肿瘤细胞与其周围环境的物质交换和能 量代谢，更重要的是两者之间的信息传递，即信号 Crosstalk机制;w]。研究证实，血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)是沟通
胶质瘤细胞与内皮细胞之间信号Crosstalk机制的 重要桥梁，可以激活胶质瘤细胞中多条信号转导通 路，参与其克隆性存活、增殖、凋亡、侵袭和血管形成 的调控，其中就包括CXCL8-A k t信号通路46:。本研究以此为切人点，从信号网络的角度对胶质瘤细胞 与血管内皮细胞之间VEGF-CXCL8-A k t的Crosstalk 机制进行研究。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞人脑胶质瘤细胞系U87M G、U25丨购自中科院上海细胞资源中心，均为胶质母细胞瘤单 克隆成系，W H O分级标准为I V级。置于含10%胎 牛血清的D M E M培养基中培养（D M EM培养液、胰 蛋白酶购自美国G ib c o公司，胎牛血清购自美国H yC lone公司）。人脑微血管内皮细胞（human brain microvascular endothelial cell, H B M E C)购于美国Sciencell公司，置于含10%胎牛血清的ECM 培养基中培养（E C M培养液、胎牛血清购自美国 Sciencell 公司）。
1.1.2 主要试剂 VEGF165、rhCXCL8购自美国 Pepro Tech 公司，LY294002 购自美国 Selleckchem 公司。兔抗人A kt及Phospho A kt单克隆抗体购自 英国Abeam公司，兔抗人G A PD H多克隆抗体(AB-P-R 001)购自杭州贤至生物科技有限公司，荧 光二抗 Goat anti-Rabbit 926-32211 购自美国 li-cor 公司Transwell小室购自美国Coming公司，B D基 质胶购自美国Sigma公司，E L IS A试剂盒购自上海 巧
伊生物科技有限公司，CCK-8试剂盒购自北京全 式金生物技术有限公司，Western blotting相关试剂 (盒）购自南京凯基生物科技发展有限公司。
1.2方法
1.2.1检测胶质瘤细胞对血管内皮细胞影响时的分 组及干预血管内皮细胞HBMEC共分为4组: ①对照组：将对数生长期的HBMEC接种于EC M中常规培养;②VEGF组：将对数生长期的HBMEC接种 于含50 ng/mL¥£0卩|65的EC M中培养;③U87M G共 培养组：将对数生长期的HBMEC接种于Transwell 下室E C M中，U87M G接种于上室，置于37t、5% C〇2中培养；④U251共培养组：将对数生长期的 HBMEC接种于Transwell下室E C M中，U251接种 于上室，置于37 t：、5% (：02培养箱中培养。
1.2.2检测血管内皮细胞对胶质瘤细胞影响时的 分组及干预胶质瘤细胞分为4组:①对照组：将 对数生长期的U87M G或U251接种于DMEM 中常
顾金海，等.胶质瘤细胞与血管内皮细胞的信号Crosstalk 对肿瘤细胞增殖和侵袭的影响24
48 72
时间(h)
图1
V EG F 干预及U87MG 、U 251共培养对H B M EC 分泌 C X C L8的影响
T <0.05以对照组，.•尸<0.01 w 对照组。
Fig.l CXCL8 secretion in HBMECs was increased by treat
ment of VEGF and co-culture with U87MG/U251 cells 7^0.05 vs control group, *7^0.01 vx control group.
2.2 HBMEC 对 U 87MG 和 U 251 细胞 Akt /P-Akt 表 达的影响如图2所示,Western blotting 检测结果显 示，与HBM EC 共培养后U 87M G 、U 251细胞P-Akt 蛋白的表达增加；如果同时给予CXCL 8干预则使 P -Akt 蛋白表达进一步升高，而给予LY 294002则使 P -A kt 蛋白的表达受到抑制，A kt 蛋白的表达无明显 影响。
3
合正态分布，数据以表示。采用双因素及单因 素方差分析，两两比较采用法。检测水准a =
〇.〇5(双尾），P <0.05为差异有统计学意义。
2
结果
2.1
VEGF 及 U 87M G 、U251 共培养对 HBMEC 分
泌C X C L 8的影响如图1所示，用ELIS A 检测 VEGF165(50 ng/m L )干预以及分别与胶质瘤细胞
U87MG 、U251共培养24、48、72h 对血管内皮细胞 H B M E C 分泌C X C L 8的影口向。数据经S -W 检验符 合正态分布。双因素方差分析结果显示，不同的处
理方法（/^哪=32.27，户<0.001；匕8屬=5.18，尸=
().013;FU 25, = 19.25，P <0.001)均能显著促进 HBMEC
细胞分泌CXCL8。与处理24 h 比较，48 h 的CXCL8 分泌量显著增多（F v e g f =12.71，户<0.001; f U 87M G = 30.78，P<0.001 ;F U 251 = 63.66, P <0.001)；与处理 48 h 比较，72 h 的C X C L 8分泌M 显著增多（F v e g f = 9.35, P<0.001；FU 87M G =72.40, P <0.001 ；Fu 25, = 60.87, P<0.001 h 不同处理方法与处理时间之间不存在交互 效应（F v e g f = 2.30，P = 0.25; FU 87M G = 4.54，P = 0.06;
FU 25, =3.08,P = 0.17) 〇
规培养;②U 87MG /U 251+HBM EC 组：将对数生长 期的U 87M G 或U 251接种于Transwell 下室常规 DM EM 中，H BM EC 接种于上室，置于37 t 、5% C 02 培养箱中培养；③ USTMG /L ^S l +HBMEC +rh - CXCLS 组：将对数生长期的 U 87MG 或 U 251 接种 于 Transwell 下室含 50 ng/mL rhCXCL 8 的 DMEM 中，HBMEC 接种于上室，置于37 t 、5%CO ：培养箱 中培养；④ U 87MG /U 251+HBMEC + LY 294002 组： 将对数生长期的U 87MG /U 251接种于Transwell 下 室含 1 |xmol/L LY 294002 的 DMEM 中，HBMEC 接 种于上室，置于37 t 、5%C 02条件下培养。
1.2.3
E L IS A 检测胶质瘤细胞对血管内皮细胞
C X C L8分泌的影响将1.2.丨中4组细胞各培养
24、48、72 h 时收集H B M E C 培养上清液，按照
ELISA 试剂盒说明书检测C X C L 8浓度值。
1.2.4 Western blotting 检测血管内皮细胞对胶质瘤
细胞A kt/P -A k t 表达的影响将1.2.2中各组细胞 培养至70%~ 80%的融合度后收集下室肿瘤细胞, 加入预冷的细胞裂解液在冰浴中充分裂解细胞，提 取全蛋白，B C A 法分析定量。Western blo ttin g 检测 计算蛋白表达量。
1.2.5 CCK -8检测血管内皮细胞对胶质瘤细胞增 殖的影响将1.2.2中各组细胞按照5x l 〇4个接种 于24孔板内在37 t 、5% C 02条件下培养24、48、 72h 后，每孔加人100 pL CCK -8液，继续在培养箱 中孵育1 h ，酶标仪测定450 n m 波长处吸光度 (OD )值，代表细胞的增殖水平。
1.2.6 Transwell 实验检测血管内皮细胞对胶质瘤 细胞侵袭的影响将B D 基质胶置于冰水浴中过夜 溶解，在超净工作台中将其用无血清培养基稀释到 浓度为1() mg /mL ，每孔吸取100卟轻轻铺到孔径 为8 (xm 的聚碳酸酯滤膜Transwell 小室内，摇匀置 于37 t 孵育箱聚合5 h 。用胰蛋白酶消化处于对数 生长期的U 87MG /U 251细胞，离心弃上清后用无血 清DMEM 重悬，调整细胞终浓度为5x l 〇5个/m L , 在Transwell 小室上层加人200 (x L ，并根据分组情 况分别加人50 ng /m L 的rhCXCL 8或1 pmol /L 的 LY 294002干预。小室下层按照l .OxlO 6个/m L 接 种HBMEC 细胞600 (x L ，然后将整个Transwell 小室 置于37 t 、5%C 02的培养箱中孵育24 h D 取出小 室，棉签擦去上层细胞;P B S 清洗，4%多聚甲醛固定 15 min ，0.丨％结晶紫染30 min , P B S 清洗，自然干 燥，显微镜下随机取5个视野拍照观察计数穿Tran - swell 小室细胞 （ ><2〇〇) 。 每组实验均重复 5 次。1.3统计学处理采用SPSS 18.0软件。定量数据 采用Spapiro -wilk ( S -W )法对其正态性进行检验，符
■付照组
_V EG F<50ng/m L )组
□ U 87M G 共培养组_U25丨共培养组
o
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244872时间(h)2448
时间(h)
图3 HBM EC以及CXCL8、LY294002对U87MG( A)和U251细胞（B)增殖的影响
•P<0.05 vs U87MG/U251 组，"P<0.01 m U87MG/U251 组，么尸<0.05,，<0.0丨vs U87MG/U251+HBMEC 组。Fig.3 Effects of HBMCEs+CXCL8/LY294002 on the proliferation of U87MG cells (A) and U251 cells (B) *P<0.05 U87MG/U251 group, *T<0.01 U87MG/U251 group, A P<0.05, ^<0.01V5U87MG/U251 + HBMEC group.
2.4内皮细胞及其分泌因子对胶质瘤细胞侵袭影 响如图4所示，Transwell侵袭实验结果显示，与 HBM EC共培养后，U87M G、U25丨穿膜细胞数分别 为 447.55 ± 30.67 和 336.25 ± 2
3.49，与 U87MG 组 (99.48±15.07)、1；251组（95.11±16.73)相比，侵袭 能力明显增加 U U S7M G= 30.62，P<0.0() 1 ;f U25,= 28.67，P<0.001)。共培养并给予CXCL8干预后U87M G和U251穿膜细胞数分别为509.73±23.49和449.04± 23.49，表明其侵袭能力在共培养的基础上进一步增 高（〜抓1。=7.丨7，<〇.〇〇1;?_=5.89，户<0.001)；而共培养时同时给予LY294002抑制则穿膜细胞数U87MG 为116.06±10.72、U251 为96.67±15.34，表明两种胶质瘤细胞的侵袭能力比共培养时降低：-27.26,P<0.001 ；tv25l =-19.92,P<0.001):
讨论
胶质瘤是一种血管依赖性极强的实体瘤，当瘤 体长到直径超过1~2 mm时，就必耑周围血管提供 额外支持，因此肿瘤和周围血管的相互“串话”(Crosstalk)就非常重要17_8]。研究证实，血管形成因 子是沟通胶质瘤细胞与内皮细胞之间信号Crosstalk
-对照组(U X7M G)B付照组(U251) U87M G+H B M E C组
2.0+ U25丨十H B M E C组
-«!«- U87M G+H B M E C+C X C L8组-A- U251+H B M E C+C X C L8 组
-A- U87M G+H B M E C+L Y294002组
^ 1.6-A- U25丨 +H B M E C+L Y294002f1i
—:-----------------B
P-Akt
Akt
GAPDH
图2 HBMEC 及CXCL8、LY294002 对 U87MG 和U251 细胞A kt、P-Akt 表达的影响。
A：U87MG；B：U251
Fig.2 Effects of HBMCEs+CXCL8/LY294002 on the Akt and P-Akt expressions of U87MG cells and U251 cells A：U87MG；B：U251.
2.3内皮细胞及其分泌因子对胶质瘤细胞增殖的 影响如图3所示，用CCK-8检测与血管内皮细胞 HBM EC共培养并同时给予A kt通路激动剂CXCL8 或抑制剂L Y29400对胶质瘤细胞U87M G和U251 增殖的影响。数据经S-VV检验符合正态分布，双因 素方差分析结果显示，与H BM EC共培养，U87MG 和U251细胞活力明显增加（F U87M G = 36. 14，P< 0.001 ;f U251= 29.78，尸<0.001) ;CXCL8 干预使其在 共培养基础上进一步增加（匕_。= 29.20, P<0.001;f U25,=2
3.53,P<0.001) ;LY29400 干预则使细胞增 殖受到抑制而表现为活力较共培养明显降低(^〇= 27.32,P<0.001；F U25, = 2
4.09,P<0.001 )0而上述3种方法对胶质瘤细胞增殖的影响会随着时 间的延长而更加明显= 33.65, P<0.001;
F U25I= 29.24，P<0.001)，其差异具统计学意义，但处 理方法和时间之间不存在交互效应（F U87M C= 4.60，P= 0.()7；F U25]=5.84,P= 0.13)
o
顾金海，等.胶质瘤细胞与血管内皮细胞的信号Crosstalk 对肿瘤细胞增殖和侵袭的影响
5
对照组 U87MG U87MG (U87MG)
+HBMEC 组 +HBMEC
+CXCL8 组100
50 0
U87MG
对照组
+HBMEC (U251)
+LY294002组
U251 U251 U251
+HBMEC 组
+HBMEC +HBMEC +CXCL8 组 +LY294002组
图4 HBMEC 以及CXCL8、LY294002对U87M G 和U 251细胞侵袭的影响（A )及分析（B 、C) (X200)
”P<0.01 vsU87MG/U251 组，^/"〈O.Ol WU87MG/U251+HBMEC 组。
Fig.4 Effects (A ) and statistical analysis ( B, C) of HBMCEs + CXCL8/LY294002 on the invasion of U87MG cells and U251 cells (x 200)
**P<0.01 vs U87MG/U251 group, ^<0.01 V 5 U87MG/U251+HBMEC group.
的重要桥梁，而V E G F 又是其中最重要的因子之 一[W °]。胶质瘤细胞内V E G F 表达增多，可以诱导 周围血管内皮细胞中多种细胞因子和生长因子的表 达水平升高，而后者正是激发肿瘤细胞持续恶性生 长的信号分子。其作为配体，与肿瘤细胞表面的特 异性受体识别结合后，启动细胞内异常信号转导通 路，参与调控肿瘤细胞的克隆性存活、增殖、凋亡、侵 袭和血管形成
目前研究表明，V E G F 可以诱导上调表达的细 胞因子和生长因子种类非常多，可以激活胶质瘤细 胞中多条信号转导通路。CXCL 8/A k t 通路即其中 最重要的细胞内信号转导通路之一。在许多胶质瘤 临床标本、原代培养细胞以及细胞系中，可普遍检测 到持续磷酸化活化的A kt 分子。而异常激活的Akt 信号通路，可通过诱导下游bcl -x l 、bcl -2、c -myc 、 cyclinDl 、survivin 、mcl-l 及 VEGF 等多种基因的表 达，调节胶质瘤细胞的生长、分化、凋亡及新生血管
形成等[15_18]。反之，靶向阻断Akt ，可有效下调胶 质瘤细胞内多种致癌基因的表达水平，明显抑制肿
瘤细胞增殖#22]。因此提示,CXCL 8/A kt 通路在胶 质瘤发病中起着非常重要的作用。
本研究探讨了 V E G F 能否促进微血管内皮细胞 分泌CXCL 8。采用含外源性VEGF 165( 50 ng /mL )
的 条件培养基孵育后，HBM EC 分泌的CXCL 8明显增 高。而与U 87M G 、U 251细胞共培养后，H BM EC 培 养体系中CXCL 8的分泌量也显示了类似的显著增 高，表明胶质瘤细胞诱导产生的内源性细胞/组织因 子能够促进血管内皮细胞CXCL 8的分泌，而结果 分析可知V E G F 正是这些因子中主要发挥作用的 成分之一，从而验证了胶质瘤细胞通过影响诱导 V E G F 表达促进周围血管内皮细胞增大CXCL 8的 分泌量，由此形成了细胞间信号由胶质瘤细胞向周 围血管内皮细胞的“串话”。
对照组
+HBMEC 组
+HBMEC
+CXCL8 组
+HBMEC
+LY294002组
U87MG
U251
o
o o o o o o o
05050505
5
4
4^3
3221
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