Vol.41No.2Feb.2021
上海交通大学学报（医学版）
JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY (MEDICAL SCIENCE)
基质金属蛋白酶响应性G4PAMAM -IBU/GelMA 水凝胶的构建及其特征研究
蔡传栋1，王
非2，崔文国2，范存义1，刘
珅1
1.上海交通大学附属第六人民医院骨科，上海200233；
2.上海交通大学医学院附属瑞金医院骨科，上海市伤骨科研究所，上海市中西医结合防治骨与关节病损重点实验室，上海200025
［摘要］目的·构建负载第4代树枝状大分子聚酰胺-胺（generation 4polyamindoamine ，G4PAMAM ）/布洛芬（ibuprofen ，IBU ）复
合物（G4PAMAM-IBU ）的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase ，MMP ）响应性明胶（gelatin ，Gel ）水凝胶，并探究其体外特征。方法·将IBU 粉末加入G4PAMAM 溶液中，经超声振荡得到G4PAMAM-IBU 复合物，利用紫外分光光度计检测饱和G4PAMAM-IBU 溶液中IBU 的浓度，研究G4PAMAM 对IBU 的增溶能力和G4PAMAM-IBU 复合物中IBU 的释放。采用CCK-8试剂盒评估IBU 与G4PAMAM-IBU 对大鼠成纤维细胞增殖的抑制能力。同时，为实现G4PAMAM-IBU 的按需释放，利用Gel 与甲基丙烯酸酐的加成反应合成甲基丙烯酸酯明胶（methacrylate gelatin ，GelMA ），并在365nm 光交联下形成MMP 响应性水凝胶，并将G4PAMAM-IBU 复合物包载于该水凝胶之中。扫描电子显微镜观察水凝胶的微观形态，紫外分光光度计测定水凝胶中药物的释放量。之后，将载药GelMA 水凝胶与成纤维细胞共培养，采用CCK-8试剂盒与活/死细胞染法评估水凝胶对成纤维细胞增殖的影响。采用单因素方差分析进行组间定量资料的比较。结果·IBU 与G4PAMAM 成功组成复合物，并使IBU 在水中的溶解度显著提高，且IBU 在12h 内与G4PAMAM 逐渐解离并释放。与空白对照组相比，单纯的IBU 浓度需达到300μg/mL 才具有抑制成纤维细胞增殖的能力（P =0.023），而G4PAMAM-IBU 中IBU 的浓度为100μg/mL 时即可显著抑制成纤维细胞增殖（P=0.000）。所制备的G4PAMAM-IBU/GelMA 水凝胶经MMP 处理后，内部孔隙增大，药物释放加快。同时，体外实验发现，与载IBU 的GelMA 水凝胶相比，G4PAMAM-IBU/GelMA 水凝胶处理后的成纤维细胞活细胞减少，死细胞增多，对细胞增殖的抑制作用显著增强（均P =0.000）；且加入MMP 后，抑制作用进一步增强。结论·G4PAMAM 对IBU 具有显著的增溶作用并可增强其药物效应；G4PAMAM-IBU/GelMA 水凝胶具有MMP 响应性的药物缓释行为，并能够持续抑制成纤维细胞增殖。
［关键词］水凝胶；第4代聚酰胺-胺；布洛芬；肌腱粘连［DOI ］10.3969/j.issn.1674-8115.2021.02.003
［中图分类号］R686.1
［文献标志码］A
Fabrication and characterization of matrix metalloproteinase -responsive G4PAMAM -IBU/GelMA hydrogel
CAI Chuan -dong 1,WANG Fei 2,CUI Wen -guo 2,FAN Cun -yi 1,LIU Shen 1
1.Department of Orthopedics,Shanghai Sixth People's Hospital,Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200233,China;
2.Department of Orthopedics,Ruijin Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine;Shanghai Institute of Traumatology and Orthopedics;Shanghai Key Laboratory for Prevention and Treatment of Bone and Joint Diseases,Shanghai 200025,China
[Abstract ]Objective ·To fabricate matrix metalloproteinase (MMP)-responsive gelatin (Gel)hydrogel loaded with generation 4polyamindoamine (G4
PAMAM)/ibuprofen (IBU)polyplexes (G4PAMAM-IBU),and investigate its characteristics in vitro .Methods ·The G4PAMAM was mixed with IBU powder to form G4PAMAM-IBU polyplexes under ultrasound vortex.The concentration of IBU in the saturated G4PAMAM-IBU solution was determined by ultraviolet spectrophotometer.The solubilization ability of G4PAMAM for IBU and the release of IBU in G4PAMAM-IBU were assessed.And the ability of IBU and G4PAMAM-IBU to inhibit the proliferation of rat fibroblasts was verified by CCK-8assay.Meanwhile,to achieve the on-demand release of G4PAMAM-IBU,Gel and methacrylic anhydride were used to synthesize methacrylate modified gelatin (GelMA)through an addition reaction,MMP-responsive hydrogel was formed under 365nm light,and the G4PAMAM-IBU polyplexes were embedded in the hydrogel.The microscopic morphology of the hydrogel was observed by scanning electron microscope (SEM)and the amount of released IBU was measured by ultraviolet spectrophotometer.Then,drug-loaded GelMA hydrogel was co-cultured with fibroblasts,and the effect of hydrogel on proliferation of fibroblasts was evaluated by CCK-8assay and live/dead cell staining.The differences in the quantitative data among the groups were analyzed by using one-way ANOVA.Results ·G4PAMAM-IBU was formed successfully,the solubility of IBU in water increased obviously,and G4PAMAM-IBU could
[基金项目]国家自然科学基金面上项目（81772314）；上海市教育委员会高峰高原学科建设计划（20191829）。
[作者简介]蔡传栋（1995—），男，硕士生；：*****************。[通信作者]刘珅，：********************
[Funding Information ]National Natural Science Foundation of China (81772314);Shanghai Municipal Education Commission —Gaofeng Clinical Medicine Grant Support (20191829).
[Corresponding Author ]LIU Shen,E-mail:********************.
论著·基础研究
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蔡传栋，等基质金属蛋白酶响应性G4PAMAM-IBU/GelMA水凝胶的构建及其特征研究
gradually dissociate within12h and thereby release IBU as well.Compared with the blank control group,the concentration of IBU alone needed to reach300μg/mL to inhibit the proliferation of fibroblasts(P=0.023),while the concentration of IBU in G4PAMAM-IBU was100μg/mL to significantly inhibit the proliferation of fibroblasts(P=0.000).The SEM images and released IBU detection results showed that the internal porosity of the prepared G4PAMAM-IBU/GelMA hydrogel increased and the release of the drug accelerated.Besides,the in vitro results showed that compared with the IBU/GelM
A hydrogel,there were less live cells and more dead cells in the G4PAMAM-IBU/GelMA hydrogel-treated fibroblasts.G4 PAMAM-IBU/GelMA hydrogel had a greater proliferation inhibitory effect than the IBU/GelMA hydrogel.And the addition of MMP further enhanced the inhibitory effect on fibroblasts.Conclusion·G4PAMAM can significantly increase the solubility of IBU and improve its drug effect;the G4 PAMAM-IBU/GelMA hydrogel has a sustained drug release behavior responding to MMP and can inhibit the proliferation of fibroblasts sustainably.
[Key words]hydrogel;generation4polyamindoamine(G4PAMAM);ibuprofen(IBU);peritendinous adhesion
肌腱粘连是肌腱损伤及其修复术后的常见并发症，发病率可达60%，严重影响患者的肢体活动［1］。目前，肌腱粘连的常常需要通过手术松解、切除粘连组织，但是术后仍有再次粘连的可能，进而形成“粘连-松解-再粘连”的恶性循环［2］。在松解过程中，应用生物材料制成的防粘连膜包裹手术修复的肌腱，可以起到物理阻隔的作用，防治肌腱粘连；但是目前的生物材料防粘连膜作用单一、疗效较差且易引发炎症，限制其临床应用［3-4］。
非甾体类抗炎药（nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）可以通过抑制环氧合酶的活性，减少前列腺素2的合成，从而抑制局部白细胞的聚集，减轻炎症反应，进而达到抑制肌腱粘连的效果［
5］。与罗非考昔等选择性环氧合酶-2抑制剂相比，作为NSAIDs之一的布洛芬（ibuprofen，IBU）能同时抑制环氧合酶-1和环氧合酶-2，因而具有更好的抑制粘连的作用［6］。然而，肌腱损伤部位血供受到破坏，限制了IBU的全身用药；因此，局部使用IBU来减轻过度炎症反应，是防治肌腱粘连的一个重要方法。本课题组在前期研究中构建了载IBU防粘连膜，该膜能够减轻肌腱损伤修复过程中的炎症反应，提高防粘连效果［7］。但是该膜的IBU释放属于被动释放，不能按需精确释放药物；此外，IBU在水中的溶解度很低，限制了其在体液中的扩散，不利于IBU进入细胞［8］。因此，制备能够按需释放药物的防粘连膜，并提高IBU的溶解度，对于更好地发挥IBU抗炎、防粘连的作用尤为重要。
在防粘连膜的生物材料中，水凝胶可以有效地阻隔粘连组织，并可作为药物缓释的良好载体。水凝胶的微孔结构允许肌腱内外侧的营养物质交换，从而促进肌腱的内源性愈合［9］。近年来，生物敏感性可降解水凝胶作为一类既可用于生物（载DNA、siRNA、蛋白质和多肽），又可用于药物释放的生物医用材料，日益受到人们的重视［10］。在肌腱粘连形成过程中，炎症阶段往往伴随着基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）含量的上调［11］，使得MMP可以成为一个合适的引发药物响应释放的“触发器”。明胶（gelatin，Gel）是一类生
物相容性较好的天然高分子［12］，分子链上有可被MMP 水解的位点［13］；利用Gel构建水凝胶材料可实现对疾病微环境响应性降解。基于此，本研究将IBU与第4代树枝状大分子聚酰胺-胺（generation4polyamindoamine，G4 PAMAM）结合后形成复合物（G4PAMAM-IBU），包载于具有
MMP响应性的甲基丙烯酸酯明胶（methacrylate gelatin，GelMA）水凝胶中，从而形成按需给药的“疾病触发-药物释放-疾病”的循环体系，然后研究该水凝胶对成纤维细胞增殖的影响，验证其防粘连作用，为防止肌腱粘连、控制炎症及促进患肢功能康复提供新的方法及理论依据。
1材料与方法
1.1主要材料和仪器
IBU（CAS15687-27-1）、Gel（CAS9000-70-8）、甲基丙烯酸酐［methacrylic anhydride（MA），CAS760-93-0］、苯基-2，4，6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂盐［lithium phenyl-2，4，6-trimethylbenzoylphosphinate（LAP），CAS 85073-19-4］购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，G4 PAMAM购自威海晨源分子材料有限公司，透析袋（截留相对分子质量为1000或3500）购自上海源叶生物科技有限公司，MMP2（SRP3118）购自上海希格玛高技术有限公司，大鼠成纤维细胞208F购自上海生物化学与细胞生物学研究所，DMEM培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清（C0227）、CCK-8试剂盒（C0037）购自上海碧云天生物技术公司，活/死细胞染试剂盒（40747ES76/80）购自上海翊圣生物科技有限公司。紫外分光度光度计（Biospectrophotometer，AG6135）购自德国Eppendorf公司，扫描电子显微镜（简称扫描电镜，Sirion200）购自美国FEI公司，倒置荧光显微镜（TI2-U）购自日本Nikon公司，多功能酶标仪购自美国BioTek公司。
1.2G4PAMAM-IBU的制备与药物释放检测
准确称量2mg IBU粉末，溶解于1mL G4PAMAM
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proliferation
溶液（2mg/mL）中，密封后超声振荡8h使IBU与G4PAMAM形成G4PAMAM-IBU。将所得溶液用蒸馏水将IBU稀释至3、6、9、12、18、24、30μg/mL的浓度梯度。以紫外分光光度计检测其紫外吸收光谱并绘制G4PAMAM-IBU浓度-吸光度值标准曲线。将G4PAMAM配成不同浓度的水溶液，分别加入足够量的IBU，密封后超声振荡8h，将所得溶液于4℃高速冷冻离心机中离心5min（5000×g），取上清液并再次离心5min（5000×g），此时上清液即为相应浓度G4PAMAM 的IBU饱和溶液。以紫外分光光度计测定其吸光度值并用G4PAMAM-IBU标准曲线计算IBU的饱和浓度。
将含IBU2mg/mL的G4PAMAM-IBU溶液稀释至200μg/mL，取稀释后溶液100μL加入透析袋（截留相对分子质量为1000），之后将透析袋密封，置于20mL去离子水中，于不同时间点取透析袋外液1mL测定紫外吸光度值，并重新补充1mL去离子水。根据所测得紫外吸光度值计算G4PAMAM-IBU的IBU释放质量以及累计释放率。
1.3G4PAMAM-IBU/GelMA水凝胶的制备与特征检测
通过Gel与MA的加成反应合成甲基丙烯酸酯明胶（methacrylate gelatin，GelMA）。简言之，将10g Gel以10%质量分数溶于磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）中，缓慢加入5mL MA，于60℃水浴锅中反应2h，期间保持温度不变。待反应结束后，过滤溶液并放入透析袋（截留相对分子质量为3500）中透析3d。透析完成后冷冻干燥即可得到白泡沫状的GelMA固体，将产物置于-20℃恒温冰箱中保存。
使用生物相容性较好的LAP作为光引发剂。将GelMA、LAP及G4PAMAM-IBU分别以5%、0.3%及0.15%的质量分数溶解于去离子水中得到GelMA预凝胶溶液，将此溶液暴露于365nm紫外光下15s即可得到载G4PAMAM-IBU的GelMA水凝胶。
将所得100μL的水凝胶浸泡于0.1μg/mL MMP2溶液中48h后取出，并与新制备的G4PAMAM-IBU/GelMA 水凝胶进行冷冻干燥。将冻干的水凝胶喷金后用加速电压5kV的扫描电镜观察被MMP降解前后的G4PAMAM-IBU/GelMA水凝胶的内部微观形态。
1.4G4PAMAM-IBU/GelMA水凝胶的药物释放检测
取200μL GelMA预凝胶溶液，经紫外光交联后成胶。将所得水凝胶置入含2mL去离子水的透析袋中（截留相对分子质量为1000），密封透析袋后放入18mL含
0.1μg/mL的MMP2溶液中，3d内于不同时间点取透析袋外液1mL测定紫外吸光度值，并重新补充1mL0.1μg/ mL的MMP2溶液。根据所测得紫外吸光度值和IBU浓度标准曲线计算G4PAMAM-IBU/GelMA水凝胶中的IBU释放质量以及累计释放率。
1.5细胞实验
1.5.1G4PAMAM-IBU对细胞增殖的影响用不同浓度的空白G4PAMAM培养基溶液培养细胞，观察其对细胞增殖的影响，并选择合适的浓度以排除其干扰作用。使用含10%胎牛血清的DMEM培养基预先于96孔板中培养208F细胞（2000个/孔），待细胞贴壁后更换为含不同浓度G4PAMAM的DMEM培养基，并以继续使用DMEM 培养的208F细胞作为空白对照组。培养48h后，使用CCK-8试剂盒检测208F细胞的活力，操作按说明书进行。
选择合适的G4PAMAM浓度，制备G4PAMAM-IBU。用含10%胎牛血清的DMEM培养基将G4PAMAM-IBU按IBU浓度分别配置为100、150、200、250、300μg/mL的含药培养基，培养已贴壁的208F细胞；同时以含相同浓度IBU（以1%二甲基亚砜溶解）的DMEM 培养基培养细胞作为对照。培养48h后，使用CCK-8试剂盒检测细胞的活力。
1.5.2G4PAMAM-IBU/GelMA水凝胶对细胞增殖的影响将208F细胞（10000个/孔）接种于24孔Transwell 细胞培养板下层，以含10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养。待细胞充分贴壁后，在Tran
swell培养板上层放入200μL空白GelMA水凝胶、载G4PAMAM-IBU（G4 PAMAM为1mg/mL，IBU为500μg/mL）或单独IBU （IBU为500μg/mL）的GelMA水凝胶；并将3种水凝胶分别浸于含0.1μg/mL MMP2的培养基（GelMA+MMP 组、G4PAMAM-IBU/GelMA+MMP组和IBU/GelMA+ MMP组）与不含MMP2的培养基中（GelMA组、G4 PAMAM-IBU/GelMA组和IBU/GelMA组）。将Transwell 培养板上层没有水凝胶的细胞组设为对照组。
将GelMA组、IBU/GelMA、G4PAMAM-IBU/ GelMA组、G4PAMAM-IBU/GelMA+MMP组细胞于Transwell细胞培养板中共培养48h后，移除上层小室，用PBS充分洗涤细胞2次，将配置好的活/死细胞染溶液（将20μL钙黄绿素和40μL碘化丙啶加入10mL PBS 中并充分混匀）250μL加入各孔中，室温避光孵育30min后吸除染液并用PBS洗涤细胞，通过倒置荧光显微镜观察。
将7组细胞于Transwell细胞培养板中共培养24h和
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蔡传栋，等基质金属蛋白酶响应性G4PAMAM-IBU/GelMA 水凝胶的构建及其特征研究
72h 后，移除上层小室，用PBS 洗涤细胞2次，加入500μL 培养基和50μL CCK-8试剂，放入37℃、5%CO 2的培养箱中孵育2h 。随后用酶标仪检测在450nm 下各孔的吸光度值。1.6
统计学分析
所有实验数据均通过SPSS 25.0软件进行分析统计，定量资料以x ±s 表示，采用单因素方差分析比较组间差异，P <0.05表示差异有统计学意义。
2
结果
2.1
IBU 与G4PAMAM 的结合与解离特征
G4PAMAM 表面的树枝状氨基可以与IBU 相结合
（图1A ）。通过紫外分光光度计测量纯IBU 在水中的溶解度以及IBU 与G4PAMAM 结合后在水中的溶解度。室温下IBU 溶解度约为85μg/mL ；IBU 与G4PAMAM 结合后，随着G4PAMAM 浓度的增加，IBU 溶解度也随之增加，其中当G4PAMAM 浓度为5mg/mL 时，IBU 溶解度达到3942μg/mL ，说明G4PAMAM 与IBU 结合可提高IBU 在水中的溶解度（图1B ）。
通过透析袋释放试验对G4PAMAM-IBU 的药物释放速度进行研究。分子量较小的IBU 可以通过透析袋进入外液，而分子量较大的G4PAMAM 则被截留于袋中。在12h 内，超过80%的IBU 与G4PAMAM 解离，表明IBU 与G4PAMAM 结合后，由于IBU 的溶解度提高且被包裹在G4PAMAM 内，可以逐渐释放至溶液中，较单纯溶解的IBU 相比，可以发挥缓释作用（图1C ）。
2.2MMP 响应性G4PAMAM-IBU/GelMA 水凝胶的特征
GelMA 分子链上含有可被MMP 特异性水解的位点，
因此被MMP 处理后，GelMA 水凝胶结构会逐渐降解（图2A ）。G4PAMAM-IBU/GelMA 水凝胶与GelMA 水凝胶冷冻干燥后经扫描电镜观察，2种水凝胶在微观结构上没有明显差别；经MMP 处理后，2种水凝胶孔隙均增大，表明水凝胶在MMP 的作用下发生了降解（图2B ）。
为了研究MMP 是否可以加速G4PAMAM-IBU/GelMA 水凝胶中IBU 的释放，我们对该水凝胶的药物释放行为进行了观察。将该水凝胶置于透析袋中，所释放
的IBU 通过透析袋进入外液，未被释放的G4PAMAM-IBU 仍在袋内的水凝胶中。与未添加MMP 相比，添加MMP 可以明显加速水凝胶中IBU 的释放，在72h 内即可完成超过70%的药物释放，说明MMP 可加速G4PAMAM-IBU/GelMA 水凝胶中IBU 的释放（图2C ）。2.3
G4PAMAM-IBU 对成纤维细胞增殖的影响
要研究G4PAMAM-IBU 对细胞增殖的抑制能力，首先要排除G4PAMAM 对细胞增殖的干扰。采用不同浓度的G4PAMAM 孵育细胞48h 后，随着G4PAMAM 浓度的增加，其对细胞抑制增殖效果也随之上升。
当
Note ：A.Schematic representation of the combination of G4PAMAM and IBU.B.Solubility increasement in water of IBU assisted by G4PAMAM.C.The dissociation of G4PAMAM-IBU polyplexes and the release of free IBU.图1IBU 与G4PAMAM 的结合与解离表征
Fig 1Characterization of combination and dissociation of G4PAMAM-IBU
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上海交通大学学报（医学版）G4PAMAM 浓度为100和200μg/mL 时，其抑制增殖效果与对照组（0μg/mL ）相比差异无统计学意义（均P >0.05）；当浓度达到300μg/mL 以上，G4PAMAM 开始显现抑制增殖的作用（均P <0.05）（图3A ）。因此选用200μg/mL G4PAMAM 进行后续实验。
与相同浓度的IBU 相比，与G4PAMAM 结合的IBU 抑制细胞增殖的作用显著提高。与空白对照组相比，单纯的IBU 浓度需达到300μg/mL 才具有抑制细胞增殖的能力，而G4PAMAM-IBU 中IBU 的浓度为100μg/mL 时就可明显抑制成纤维细胞增殖（图3B ）。
2.4G4PAMAM-IBU/GelMA 水凝胶对成纤维细胞增殖的影响
水凝胶与成纤维细胞共培养48h 后，GelMA 组细胞
情况良好，活细胞多，几乎未见死细胞，说明GelMA 水
凝胶的生物相容性较好。与IBU/GelMA 组相比，G4PAMAM-IBU/GelMA 组活细胞数量减少，死细胞数量增多；G4PAMAM-IBU/GelMA 组添加MMP 后，活细胞数量进一步减少，死细胞数量进一步增多（图4A ）
，说明
Note ：A.Schematic representation of G4PAMAM-IBU/GelMA hydrogel formation and degradation under MMP.B.Microstructures of blank GelMA and G4PAMAM-IBU/
GelMA hydrogel with or without MMP treatment.C.Responsive release of IBU from G4PAMAM-IBU/GelMA hydrogel with or without MMP treatment.图2MMP 所致GelMA 水凝胶的降解及G4PAMAM-IBU/GelMA 水凝胶中IBU 的响应性释放
Fig 2MMP-induced GelMA hydrogel degradation and MMP-responsive IBU release from G4PAMAM-IBU/GelMA
hydrogel
Note ：A.Inhibitory effect of G4PAMAM on cell proliferation.①P =0.023,②P =0.004,③P =0.001,compared with G4PAMAM 0μg ·mL -1.B.Inhibitory effects of IBU and
G4PAMAM-IBU on cell proliferation.④P =0.023,⑤P=0.000,compared with IBU 0μg
·mL -1
.图3G4PAMAM 与G4PAMAM-IBU 对成纤维细胞增殖的抑制作用
Fig 3Inhibitory effects of G4PAMAM and G4PAMAM-IBU on cell proliferation
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