基因组学与应用生物学，2020年，第39卷，第11期，第5333-5339页
研究报告
Research Report
N M D A-R阻断对少突胶质细胞增殖的影响及其可能的机制
姜晓迪1陈静■张蕾2窦霄云1唐勇2修芸”
1重庆医科大学，生命科学研宄院，重庆，400016; 2重庆医科大学基础医学院，重庆,400016
*通信作者,******************
摘要为探讨N-甲基-D-天冬氨酸受体(N M D A-R)在少突胶质细胞增殖中的作用及其可能的机制。本 研究以C57B L/6J小鼠原代少突胶质细胞为研究对象，随机分为对照组和M K-801组，运用C C K-8、E d U方 法检测细胞增殖情况，运用q R T-P C R及Western blot技术检测N M D A-R亚基N R1、N R2C、N R3A m R N A及 蛋白表达情况。结果证实N M D A-R阻断剂M K-801呈浓度依赖性减少少突胶质细胞数量，即随着M K-801 浓度增加，少突胶质细胞数量逐渐减少；M K-801组少突胶质细胞增殖数量(32.95±8.47)%较对照组(42.44± 7.35)%明显减少(；)=0.015)；与对照组比较，M K-801组少突胶质细
胞N M D A-R亚基N R1m R N A (1.04± 0.29 vs0.53±0.27,p=0.01<0.05)及蛋白表达(1.00±0.10 vs O J Q t O.a/^O.O W c O.O S)均降低,N R3A亚基 m R N A 表达也降低（1.08±0.15 vs 0.79±0.25,P=0.038<0.05)，但 N R2C 亚基 m R N A 表达无变化（].18±0.08 vs 丨.02± 0.17，P=0.519>0.05)。N M D A-R被阻断剂M K-801阻断后对少突胶质细胞的增殖具有抑制作用，这种作用可 能通过下调N R l、N R3A亚基来介导。
关键词少突胶质细胞，N-甲基-D-天冬氨酸受体,M K-801，细胞增殖
Effect o f N-methyl-D-aspartate Receptor Antagonism on Proliferation o f Mouse Primary Oligodendrocytes
Jiang Xiaodi1C h e n Jing1Z h a n g L e i2D o u X i a o y u n1T a n g Y o n g2X i u Y u nproliferation
1Institute of Life Sciences, Chongqing Medical University, Chongqing, 400016; 2 Basic Medical College of Chongqing Medical University, Chongqing, 400016
*Correspondingauthor,******************
DOI: 10.13417/j.gab.039.005333
Abstract T o investigate the effects of N-methyl-D-aspartate receptor(N M D A-R)o n proliferation of primary cul­tured m o u s e oligodendrocytes.T h e primary oligodendrocytes of C57B L/6J m i c e w e r e cultured a n d purified in vitro, and r a n d o m l y divided into M K-801 group and control gr o u p.C C K-8a n d E d U m e t h o d s w e r e used to detect the ef­fects of M K-801 o n the proliferation of O P C s.T h e m R N A of N M D A-R subunits N R l,N R2C a nd N R3A w e r e a n­alyzed b y real time R T-P C R and N R l protein expression w a s tested b y Western Blot technique.N M D A-R antago-nist M K-801 reduced the n u m b e r of oligodendrocytes in a concentration-dependent m a n n e r,that is,as the c o n c e n­tration of M K-801 increased,the n u m b e r of oligodendrocytes decreased.T h e n u m b e r of proliferating oligodendro­cytes in M K-801 group(32.95±8.47)% w a s significantly lower than that in the control group(42.44±7.35)% (/>=0.015).
C o m p a r e d with the control group,the N M
D A-R subunit N R l m R N A(1.04±0.29 vs0.53±0.27, p=0.01<0.05) a n d protein expression(1.00±0.10 vs0.79±0.17,p=0.016<0.05) w e r e significantly down-regulated after M K-801 treat­m e n t.T h e expression of N R3A subunit m R N A significantly decreased(1.08±0.15 vs0.79±0.25, p=0.038<0.05),
基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(81301149)资助
引用格式：Jiang X.D., C h e n J” Z h a n g L” D o u X.Y.，T a n g Y.，a n d X i u Y.，2020, Effect o f N-methyl-D-aspartate receptor a n t a g o n i s m o n proliferation o f m o u s e pr i m a r y oligodendrocytes, Jiyinzuxue Y u Y i n g y o n g S h e n g w u x u e (G e n o m i c s a n d A p p l i e d Biology), 39(11): 5333-5339(姜晓迪，陈静，张蕾，窦霄云，唐勇，修芸，2020, N M D A-R阻断对少突胶质细胞增殖的影响及其可能的机制，基因组 学与应用生物学,39(11): 5333-5339)
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but the expression of N R2C subunit m R N A s h o w e d n o significant difference between the t w o groups (1.18±0.08 vs 1.02±0.17,p=0.519>0.05). N M D A-R antagonism by M K-801 has an inhibitory effect on the proliferation of oligodendrocytes,w h i c h m a y be mediated b y down-regulating N R1,N R3A subunits.
K e y w o r d s Oligodendrocyte,N-methyl-D-aspartate receptor,M K-801, Cell proliferation
N M D A-R，即N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate)受体是一种由谷氨酸激活的配体门控性 离子通道，在学习、记忆及突触形成等方面发挥重要 作用（Paoletti a nd N e y t o n，2007; S a n z-Clemente et al.，2013)。以往研宄认为N M D A-R主要分布在神经元，但 近年来陆续报道称，少突胶质细胞突起末梢及髓鞘 上也有 N M D A-R 表达(Karadottir et al., 2005; Salter and Fern,2005)，但其
亚基构成与神经元上N M D A-R 不同：少突胶质细胞N M D A-R主要由N R1、N R2C和 N R3A亚基构成，其功能也区别于神经元上N M D A-R，仅能被胞外二价镁离子微弱阻断(B u r z o m a t o et al., 2010)。少突胶质细胞N M D A-R参与缺血时白质损伤 的发生(Salter a nd Fern,2005)，本研究拟采用原代培 养少突胶质细胞系统，探讨N M D A-R在细胞增殖过 程中的作用及其可能的机制。
1结果与分析
1.1细胞纯度满足实验要求
为确保细胞培养所获细胞为少突胶质细胞谱系，本实验以细胞形态及免疫荧光标记对少突胶质细胞 进行了鉴定。培养4 d时，细胞多为突起较少的前体 细胞；培养至5〜7 d时，细胞多为单极或双极；培养至 10〜丨2d时，细胞突起更多(图丨)。与文献报道(Miron etal.,2011)原代少突胶质细胞不同发育阶段的形态 一致。免疫荧光标记显示(图2),01ig2+细胞占D A P I+细胞数为(84.19±3.64)%，细胞纯度满足实验要求，可 用于后续实验检测分析。
4d7d10 d
图1光镜下不同时期(4 d, 7 d, 10 d)少突胶质细胞的典型形态 Figure 1Typical cell m o r p h o l o g y o f oligodendrocyte precursor cells (O P C s) in different cultured d ay s (4 d, 7 d, 10 d) observed u n d e r inversion mi c r o s c o p e 1.2 M K-801对少突胶质细胞增殖的影响
为选取最适药物作用浓度，向培养的细胞中分 别加入浓度为 0.1 j i m o l/L J jjunol/L、10 p m o l/L、20 p m o l/L J O |x m o l/L、100 |x m o l/L 的M K-801 作用24 h和48 h(每个浓度设置3〜5个复孔)。与对照组 相比，0.丨|x m o l/L〜100 |x m o l/L范围内，随着M K-801浓度增加，活细胞数量逐渐下降(图3)。lOjjimol/L M K-801作用48 h能显著减少少突胶质细胞数量，故后续实验均选用此浓度和作用时间。为验证N M-D A-R被阻断后细胞数量的降低是否通过抑制增殖 实现，本研究采用了 E d U方法来验证(图4)。加入M K-
01ig2 D A P I
A B
&加
Overlay
C D
图2少突胶质细胞前体细胞免疫荧光染
注:A〜C：少突胶质细胞的特异性标志物01i g2 (红)，D A P I核染(蓝)及共表达免疫荧光染;D：细胞体外培养体系中Olig2 阳性细胞数的构成比
Figure 2 I m m u n o f l u o r e s c e n c e staining o f oligodendrocyte precur- sor cells
Note: A~C:I m m u n o s t a i n i n g with the antibody 01ig2, a specific m a r k e r for oligodendrocytes (Red), D A P I nucleus staining (Blue), a n d the m e r g e o f both staining; D: T h e percentage o f O H g2-p o s i­tive cells in
cultured system
NMDA-R 阻断对少突胶质细胞增殖的影响及其可能的机制5335
图4 E d U 检测加入M K -801后O P C s 的数量及阳性细胞所占 比例
注：A : M K -801处理细胞48 h ，并通过E d U 检测细胞增殖情
况；E d U  (红)和H o e c h s t  33342 (蓝)合并进行免疫荧光染
;B ：统计分析M K -801组和对照组中E d U 阳性细胞的百分 比;*:/><0.05
Figure 4 T h e  n u m b e r  o f  O P C s  a n d  the proportion o f  positive cells after M K -801 addition w e r e  detected b y  E d U
Note: A : T h e  cells w e r e  treated with indicated concentration o f  M K -801 for 48 h, a n d  cell viability w a s  m e a s u r e d  b y  E d U  to as­sess the cell proliferation; T h e  m e r g e  o f  E d U  staining (R e d ) a n d  H o e c h s t  33342 staining (Blue) for cultured cells; B: T h e  statistical
analysis results o f  the percentage o f  EdU-positive nuclei in
M K -801 a n d  control group; *: ；><0.05
(Karadottir  et  al .，2005; Salter  a nd  Fern , 2005)。基于 此，研究者提出，“少突胶质细胞N M D A -
R 很可能是 白质损伤修复的新耙点”(M a t u t e , 2006)。值得一提的是，有研究发现，正常情况下长期 阻断N M D A -R 也会引发白质髓鞘损伤(X i u  et  al .,2015)。以P C P  (苯环己)阻断N M D A -R 建立的精 神分裂症大鼠模型中，其大脑皮层出现脱髓鞘改变, 少突胶质细胞相关蛋白和M B P 的表达降低(Z h a n g e t  al .，2012)。E d w a r d  Roberts  等(2014)的研究发现在长 期服用(N M D A -R 阻断剂)的患者大脑中可见 白质内纤维的广泛性损伤。一方面，少突胶质细胞上 N M D A -R 激活过度能导致细胞和大脑白质损伤； 另一方面,N M D A -R 阻断后也能引起大脑白质、髓 鞘损伤。
空n
Blank M K -801
Concentration (^imol/L)
图3不同浓度的M K -801对O P C s 细胞活力的影响
注:C C K -8测定法测量细胞活力，M K -801的最终作用浓度为 10 p m o l /L ，处理时间为48 h ，实验独立重复3次；*: P <0.05;**：p <0.0\Figure 3 O P C s  activity o f  M K -801 at different concentrations Note: Cell viability w a s  m e a s u r e d  b y  C C K -8 assay, a n d  the final concentration o f  M K -801 w a s  10 ^m o l /L  for 48 h; E x p e r i m e n t s  w e r e  p e r f o r m e d  in triplicate; *: p<0.05; **: /?<0.01801后，M K -801组E d U  (红)/Hoechst  (蓝)细胞数
量比值为(32.95±8.47)%，与 Control  组(42.44±7.35)% 相比显著减少，且差异具有统计学意义(p =0.0154<0.05)。1.3 M K -801对N M D A -R 亚基表达的影响与对照组相比，M K -801处理细胞48 h 后,N R 1- m R N A  表达量降低(丨.04±0.29 vs  0.53±0.27，/>=：0.01< 0.05)(图5A ),N R 1蛋白表达同样降低(1.00±0.10vs 0.79±0.17，p =0.016<0.05)(图 5B )，N R 2C  m R N A  没有显 著差异(1.18±0_08vs  1.02±0.17，/>=0.519>0.05)(图5八)， N R 3A  m R N A  表达量降低（1.08±0.15 vs  0.79±0.25, p =0.038)(图 5A )。2讨论多种神经精神疾病，如精神分裂症、抑郁症、多 发性硬化等都会发生不同程度的脱髓鞘病变(Desai etal .，2016)。少突胶质细胞是在中枢神经系统内负责 髓鞘形成的神经胶质细胞，其任何发育阶段的功能 缺失，都有可能导致髓鞘形成与再生受损。以往研究 认为，少突胶质细胞及其前体细胞的损伤仅由A M - P A /K A 受体的激活引起，因为研宄者在少突胶质细胞 上并没有检测到N M D A -R 的表达(Tekkak  and  G o l d ­berg , 2001)。 但最近研宄发现， 大鼠发育中的少突胶 质细胞胞体、突起及髓鞘上均有N M D A -R 受体亚基 N R 1、N R 2C 和N R 3的表达，并介导缺血性白质损伤 的发生，因为预先给予A M P A 受体阻断剂N B Q X 并 不能减轻损伤，而预先给予N M D A -R 拮抗剂M K - 801则可显著减轻少突胶质细胞突起的损伤及丢失K
M 91
空B 1o e J J
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5336 基因组学与应用生物学
图 5 N M D A -R  被 M K -801 阻断后亚基 N R 1，N R 2C , N R 3A  的表达注：A ：实时定量P C R 数据表明N R 1,N R 2C 和N R 3A 基因的 m R N A 水平;N R 1和N R 3A 基因在M K -801组中表达低于对 照组，N R 2C 基因表达没有差异；*:P <0.05; B: W e s t e r n  B l o t 测 定M K -801处理后少突胶质细胞中N R 1蛋白的表达；p-actin 用作上样对照;C ：统计分析M K -801组中N R 1蛋白表达量;*: p <0.05Figure 5 Effect o f  M K -801 (N M D A -R  antagonist) o n  N M D A -R  subunits (N R 1, N R 2C  a n d  N R 3A )Note: A : Real-time quantitative P C R  data s h o w e d  that, m R N A  lev­els o f N R l , N R 2C  a n d  N R 3A  genes; *: p<0.05; B: N R 1 protein in
oligodendrocyte after M K -801 treatment w a s  m e a s u r e d  b y  W e s t ­ern Blot; p-actin w a s  u s e d  as the internal control; C: N R 1 protein expression after M K -801 treatment; *: p <0.05那么，少突胶质细胞N M D A -R 在白质损伤及修 复中究竟起什么作用？正如1<：〇丨〇[12丨扣2丫1<；等(2010)在 综述文章“少突胶质细胞系为什么要表达谷氨酸受 体?”中质疑的那样:“少突胶质细胞N M D A -R 除了介 导缺血情况下的白质损伤，难道就没有其他的积极作 用吗？ ”本研究通过体外原代少突胶质细胞培养验证 N M D A -R 在细胞增殖的作用，C C K -8和E d U 结果显 示，N M D A -R 阻断剂M K -801能够抑制少突胶质细 胞增殖，反向印证了少突胶质细胞N M D A -R 在细胞 增殖中的重要作用。转录组分析表明，N M D A -R 在 O P C s 中的m R N A 表达随着细胞成熟为髓鞘化少突 胶质细胞降至低水平(C a h o y  et  al .，2008)，提示少突胶 质细胞N M D A -R 在细胞发育早期及包裹轴突形成髓
鞘过程中发挥重要作用。本研究中，培养少突胶质细胞一般取自出生1〜2d 乳鼠培养7〜10 d ，此时期为少 突胶质细胞发育早期。该方法是对上述科学假设的
有益补充。
N M D A -R 为不同亚基单位组成的异四聚体配 体门控性离子通道，目前己有7个N M D A -R 亚基单
位被确认，它们分别是G l u N  1、G l u N 2A 、G l u N 2B 、
G l u N 2C 、G l u N 2D  和 G l u N 3A 、G l u N 3B 。其中，N R 1 亚
基对于N M D A -R 的正确组装和功能行使是必需的，
是N M D A -R 的核心亚单位；N R 2和N R 3亚基赋予
细胞不同的生物、物理和药理学性质，是重要的调节
亚单位(P6rez-Otafio  et  al .，2016)。研宄表明，少突胶质
细胞N M D A -R 主要由N R 1、N R 2C 和N R 3A 亚基构
成，其功能也区别于神经元上N M D A -R  (Burzomato
et  al ., 2010)。本研究，在培养少突胶质细胞上检测到
了 N R 1、N R 2C  和 N R 3A  亚基 m R N A  的表达，N M -
D A -R 阻断剂M K -801处理48 h 后，少突胶质细胞的
N R
1和N R 3A  m R N A 水平显著降低，但N R 2C  m R ­N A  表达没有明显变化。
以往，为探讨(K e t a m i n e )滥用引发精神症 状和N M D A -R 阻断引发精神分裂症的可能机制，研 宄者对k e t a m i n e 或M K -801等N M D A -R 阻断剂长 期应用后N M D A -R 亚基的表达进行了检测。L i u 等 (2011)发现，k e t a m i n e 可显著上调S D 大鼠前额叶皮层 内N R 1亚基m R N A 的表达；另有研宄表明，M K -801 可显著下调海马背侧区域及外背侧丘脑部位N R 1 亚基的表达，但上调海马腹侧区N R 1亚基的表达，可 能是不同的神经投射方式导致了这种差异。本研究
首次在离体培养少突胶质细胞的层面上探讨M K -
801 对 N M D A -R  亚基表达的影响，将少突胶质细胞
N M D A -R 作为研究单位，而不是以往动物研宄中神
经元和少突胶质细胞N M D A -R 的整体效应，为白质 损伤在精神类疾病中作用机制的研宄提供了重要的 实验依据。
相对于N M D A -R 其他亚基单位,N R 3亚基发现 仅有十几年的历史，但它的发现却将N M D A -R 的复 杂性提升到了 一个新高度。N R 3A 亚基在体内表达具 有鲜明的时空特性：在胚胎发育后期,N R 3A 转录水 平增加，出生后前2周达到高峰，随后迅速下降并维 持在低水平(L o w  a nd  W e e , 2010)。起初，研宄者认为 N R 3A 可能仅在发育早期发挥作用。然而，M o h a m a d  等(2013)却发现,N R 3A 在成年小鼠痛觉及认知行为 中也发挥重要作用。此外，有研究表明(Mueller  and M e a d o r -W o o d r u f , 2004)精神分裂症患者的前额叶皮 质背外侧(dorsolateral  prefrontal  cortex , D L P F C ) N R 3A
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<u 3>J B l <u o i u o l s tA S J d x u U A I J e o l
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NMDA-R阻断对少突胶质细胞增殖的影响及其可能的机制5337
m R N A表达增加，但仅在脑回区域，提示N R3A在 精神分裂症中可能发挥作用。本研究中，N R3A下调 可能在M K-801对少突胶质细胞增殖抑制作用中发 挥作用。
因此，本研究在细胞层面上证实N M D A-R被抑 制剂M K-801阻断后可抑制少突胶质细胞前体细胞 增殖，并且主要是通过对N R1和N R3A亚基的调控 来实现。为今后研究各类脱髓鞘相关的精神疾病提 供了一个较好的靶点，为N M D A R，尤其是N R1与 N R3A在神经系统发育和损伤修复的作用和相关疾 病的临床研宄提供了重要依据。
3材料与方法
3.1实验材料
3.1.1实验动物
新生1~2 d内C57B L/6小鼠，购自重庆医科大 学动物实验中心。原代培养少突胶质细胞，随机分为 对照组和M K-801组。
3.1.2主要试剂
D M
E M/F12 培养基、胎牛血清(Fetal Bovine Se-r u m)、Hank's平衡盐溶液、N2 Supplement均购于美国 Gibco 公司。多聚赖氨酸(poly-L-lysine,P L L)、L-谷氨 酸均购自美国S i g m a公司。层粘连蛋白(Lami
nin)购 于丨nvitrogen公司。C C K-8购于日本东仁化学研究 所，E d U试剂盒购于广州锐博公司。兔抗少突胶质 细胞转录因子 2 (oligodendrocyte transcription factor2,〇lig2)多克隆抗体、兔抗N-甲基-D-天冬氨酸受体 亚单位(N-methyl-D-aspartate receptor subunit 1，N M-D A R1)均购自美国Millipore公司，兔抗(3-actin多克 隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。R I P A裂 解液、蛋白酶抑制剂(P M S F)、上样缓冲液、D A P I核染 试剂购自上海碧云天生物公司。T R I Z O L、逆转录试 剂盒、S Y B R Premix Ex 7^II、D E P C 水购自日本T a K a R a公司。N M D A-R 抑制剂 M K-801 (M107)购 自美国S i g m a公司。
3.2实验方法
3.2.1少突胶质细胞分离纯化培养及鉴定
将新生1〜2 d小鼠在酒精中消毒2〜3 m i n，断头 后在P B S缓冲液、H B S S缓冲液中迅速分离出皮层 组织，去掉脑膜和血管后用手术刀片切成1m m3大 小的组织块，在含10% F B S和1%青霉素-链霉素的 D M E M/F12原代培养基中吹散分离成悬液，接种到多聚赖氨酸包被的培养皿中；培养至4〜5 d时，更换 为增殖培养基(15% B104上清+1 %N2 Supplement+ 1%青霉素-链霉素+83% D M E M/F12培养基)；培养 约7 d时，用D N A酶I和0.02%E D T A消化分离 O P C细胞，离心后重悬，重新接种O P C s。培养24h 后，每天100 p m o l/L谷氨酸刺激细胞20 m i n连续作 用至少3d，之后针对不同的实
验做出不同的处理。以兔抗01ig2免疫荧光标记O P C s，D A P I标记细胞 核，计数〇1i g2阳性细胞数占总细胞数的比例，确定 少突胶质细胞的纯度。
3.2.2细胞药物作用浓度的确定
将纯化的O P C s传代至96孔板中，加入M K-801终 浓度分别为 (xmol/LJ (xmol/L、10(jLmol/L、20 (xmol/L、50 (xmol/L 和 100 |xmol/L 的培养基进行 培养，分别培养24 h和48 h，再加入C C K-8溶液按 1:100与增殖培养基混合，继续孵育4 h后用多功能 酶标仪于450 n m波长处测定每个孔的吸光度，计算 M K-801不同药物浓度作用下细胞的活性。
3.2.3细胞增殖能力的检测
通过检测渗入细胞D N A复制期间的E d U，借助 荧光检测工具即可快速准确地检测出处于S期的细 胞百分数，分析细胞增殖情况。将纯化O P C s按每孔 500 p L,6x104个/孔的浓度制备细胞爬片，24 h后加入 10|xmol/L的M K-801 作用 48 h。加入 E d U(l:5000)继 续孵育24 h后，将细胞爬片取出，进行如下步骤：用 P B S清洗3遍，4%的多聚甲酸固定30m i n，用2 m g t n L 甘氨酸摇床振荡孵育5 m i n,0.5% TritonX-100渗透 剂摇床振荡孵育丨0 m i n,A pollo染反应液避光室 温摇床振荡孵育30 m i n,lx Hoechst33342反应液避 光室温摇床振荡孵育30 m i n，最后以P B S漂洗，使用 抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察计数。3.2.4 q R T-P C R 检测 N M D A-R 亚基 m R N A 的表达 情况
用Trizol试剂提取少突胶质细胞总RNA，逆转 录合成cDNA，以此为模板进行NMDA-R亚基(NR1，NR2C,NR3A)和内参办-的扩增。弓丨物序列己列出(表丨）。扩增条件为95°C45 s,57°C30 s,72-C45 s，扩增 40个循环。每个样本均设置3个复孔，实验至少重复 3次，用2 ^法分析目的基因的相对表达量。
3.2.5 Western-blot检测 N M D A-R亚基 N R1 的表达
待细胞密度为85%〜90%时，用R1P A 裂解液冰

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