细胞侵袭必备技能——Transwell
导读 上周我们介绍了研究细胞迁移的体外方法——划痕实验，与此同时细胞侵袭也是与转移密不可分的。那么今天要讲的是最常用的细胞侵袭方法：Transwell小室侵袭实验。与细胞划痕实验相比，Transwell相对过程复杂，因此常常会出现各种问题，下面就一起看看Transwell侵袭实验中需要注意的细节吧！
首先，为了对肿瘤侵袭和转移有更加清晰的理解，我们先来了解一下，肿瘤细胞转移的过程（如图1），主要包括以下5个过程：
原位侵袭（Local invasion），肿瘤细胞内渗（Intravasation），循环系统存活（Survival in the circulation），肿瘤细胞外渗（Extravasation），形成转移灶（Micrometastasis formation）等[1]。
肿瘤细胞转移过程[1]
其中细胞侵袭便发生在第一步，即肿瘤细胞在原位突破基底膜，然后内渗进入血管、淋巴管的过程，后期才开始进行转移。本期我们就为大家讲述利用transwell小室模拟细胞侵袭的实验方法。
Transwell 实验原理
Trans可译为转移，穿过，而well则为小室的意思。外形如同一个小杯子，杯底有通透性的膜（孔径0.1－12.0µm，细胞侵袭一般用8.0、12.0μm）。
实验原理：将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以膜相隔，并在膜上室铺基质胶，用来模拟体内细胞外基质。如果上室的细胞要转移到下室，需先分泌基质金属蛋白酶（MMPs ）将基质胶降解，才能通过膜，最后通过计数下室的细胞量即可反映细胞的侵袭能力。如下图右所示：
Transwell装置图（左为外形，右为内部构造）
侵袭过程：如下图为利用血清为诱导因子，模拟肿瘤细胞侵袭的过程。简单来说即：膜可以将上下室的营养液隔开，如下室常为有血清培养基。这样细胞放无血清的培养基里，为了吃的更好会往下跑，但是有膜挡着，所以要穿过膜才行。此时膜上涂一层基质胶，就可
模仿细胞外基质，细胞必须要把基质消化了才可跑到下室，最后计算下室的细胞量即可反应细胞的侵袭能力。
横纹肌肉瘤细胞侵袭图[2]
具体实验步骤
一、实验材料（提前1天准备）
1.Transwell小室
2.基质胶  常用的是人工重构基底膜材料Matrigel，需要提前12h将Matrigel胶从-20℃取出于4℃冰箱过夜。因其4℃时是液体，在 37℃会逐渐凝固成胶状，且不可逆。它能在培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。如果购买的小室是已经铺好基质胶的，那么Matrigel就不需要购买了。
3.上层培养液  上层培养液采用无血清培养基，为维持渗透压，可以加入0.05%-0.2%BSA；
4.下层培养液  下层培养液采用含5%－10%FBS的培养基，具体浓度根据细胞转移力而定，转移力弱的细胞可适当提高FBS浓度。下层也可用趋化因子“引诱”细胞转移，如将纤维粘连蛋白加入下层培养液作为趋化因子；
5.细胞培养板  常用6孔板、12孔板、24孔板等。其中，以24孔板最常用，下面就以24孔板为例。
二、 实验步骤
1. 铺基质胶：在4℃条件下将Matrigel胶用无血清的细胞培养基或PBS缓冲液按照1：8比例
稀释（其稀释比例需要摸索，选择一个细胞穿过适中的浓度即可），取100μl均匀涂抹于上室的聚碳酸酯膜表面，37℃放置0.5-1h，使其聚合成凝胶；
Tips:
1.将头沿小室内壁将Matrigel轻轻打出，切忌戳到小室滤膜；
2.加入的Matrigel胶的体积不可太大，把聚碳酸酯膜浸湿即可；
3.注意低温，头、小室等都应该4℃预冷。
2. 细胞培养：取对数生长期的待测细胞，并用PBS洗涤，接着用无血清培养基悬浮细胞，调整细胞密度为1-10*105/ml；
3. 接种细胞：在24孔板下室一般加入500-650 μL 含 5%-10%FBS 或趋化因子的培养基，然后用镊子将Transwell小室置于24孔板内，取细胞悬液100－200μL 加入上室，最后放入培养箱中培养12-48h（根据癌细胞的转移能力而定）。
proliferation
Tips:

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