DNA分子标记及其在作物遗传育种中的应用
摘 要：本文对四种DNA分子标记技术的原理和特点，以及不同DN A分子标记在作物亲缘关系与遗传多样性、指纹图谱的建立、遗传图谱的构建与基因定位、及分子标记辅助选择育种等方面所取得的应用效果进行了较为详尽的论述，充分展示这项技术的发展具有巨大的应用潜力和广阔的应用前景。
关键词：DNA分子标记；遗传育种；应用
伴随着人们对生命认识的不断加深以及遗传学的发展，遗传标记（genetic marker）的种类和数量越来越多，主要分为四种类型：形态学标记、细胞学标记、生化标记和DNA分子标记。前三种标记都是以基因表达的结果(表现型)为基础，是对基因的间接反映；而DNA分子标记则是DNA水平遗传变异的直接反映。
1.分子标记（molecular marker）
广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义的分子标记只是指DNA标记。DNA分子标记是以生物DNA的多态性为基础的遗传标记，与其他遗传标记相比，它具有以
variable怎么记下优点：（1）直接以DNA的形式表现，在生物各个组织，各个发育时期都可检测到，不受季节、环境限制；（2）数量极多，遍及整个基因组；（3）多态性高，并且自然存在许多的等位变异，不需专门创造特殊的变异材料；（4）表现“中性”，即不影响目标性状的表达，与不良性状也没有必然的连锁；（5）许多分子标记表现为共显性，能够鉴别纯合基因型与杂合基因型，提供完整遗传信息。因此，DNA分子标记已广泛地应用于种质资源研究、目的基因定位、遗传图谱构建和分子标记辅助选择等各个方面。根据检测手段的不同，DNA标记技术综合起来可分为以DNA杂交为基础的、以PCR技术为基础的、以串联重复的DNA序列为基础的以及基于单核苷酸多态性的DNA标记四种类型。不同的DNA分子标记之间既有共性又有各自的特点，这里就常用的几种标记技术作简要介绍。
1.1 以DNA杂交为基础的分子标记
该标记是利用限制性内切酶酶解不同生物体的DNA分子后，用经标记过的特异DNA探针与之进行Southern杂交，通过放射自显影或同位素显技术来揭示DNA多态性，主要包括RFLP标记和VNTR标记。
1.1.1限制性片断长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)标记
    RFLP标记是指用限制性内切酶处理不同生物个体的DNA所产生的分子片断大小的差异。此技术基于生物个体的基因组的变异，是研究不同基因组间的差异的技术，由Grodztcker于1974年首先提出。
其基本原理是：物种经过长期的进化各个种属甚至品种之间的同源DNA序列上的限制性内切酶识别位点不同，或者由于突变、重组等原因引起限制性内切酶位点上的核苷酸的变化。若引起DNA分子某一特定内切酶识别位点序列内发生变化，这样该位点就不能被切开，使得DNA片断比亲本长；若突变后形成新的酶切位点，则酶切后的片断变短。这样，通过电泳可以将大小不同的片断区分开来。对于分子量较小的质粒DNA就可直接观察到DNA长度的差异，但对于核DNA而言DNA片断呈连续分布，无法辨别差异，需通过Southern杂交将电泳结果转移至支持膜上，用单拷贝或低拷贝的DNA克隆作为探针与膜上的酶切片断杂交，通过放射自显影或非同位素显技术，发生变异的材料显示的带就可能与亲本的带处于不同位置。检测出与此标记DNA相关的片段构建出多态性图谱，即为RFLP。
    这种特定的限制性片断与DNA探针的组合，便可以作为遗传标记。由于RFLP起源于DNA的变异，不受显隐性关系、环境条件和发育阶段的影响，具有遗传的专一性和稳定性的特点，
在数量上不受限制，可随机选取足够数量能代表整个基因组的RFLP标记，而且每个标记变异大，检测方便。用于检测RFLP的克隆探针可随机选取，可以是核糖体DNA、叶绿体DNA、也可以是总DNA。这样就可以获得能够反映遗传差异的大量多态性，为进行资源分析、品种鉴定、物种进化、基因定位、亲缘关系和遗传距离的分析，遗传图谱的构建提供了有力的工具。并且RFLP是共显性标记，能够区别出杂合体与纯合体。
虽然RFLP具有结果稳定可靠，重复性好，特别适合建立连锁图等优点，但也具有检验步骤多、周期长、成本高等缺点。并且RFLP对DNA多态性检出的灵敏性不高，RFLP连锁图谱上还有很大的空间区(gap)，甚至在使用同位素时可能对人有一定的伤害等等。这些都是需要进一步完善的地方。
1.1.2重复数可变串联重复标记(Variable Number of Tandem Repeat，VNTR)
VNTR标记产生的多态性是由同一座位上的串联单元数量不同而产生的，可进行分子定位和作图的研究工作。
1.2 以PCR为基础的分子标记
1.2.1 随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA,RAPD)
随机扩增多态性DNA(RAPD)是美国杜邦公司的Williams(1990)和加利福尼亚生物研究所Welsh等(1990)领导的两个小组同时发展起来的一种新的DNA指纹技术。此技术是应用一系列随机引物扩增并寻多态性DNA片段的遗传标记技术。这一技术建立在PCR反应基础之上，以随机的短脱氧核苷酸(通常为10个碱基)作为PCR引物，对基因组DNA进行扩增而产生多态的DNA图谱。扩增产生的片段可通过琼脂搪电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分开，经溟化乙锭染或银染得到多态性的DNA图谱后进行多态性观察。在基因组上，每个引物可以连续直接扩增特定的DNA片段，对一个特定的基因型来讲，这些扩增的片段或片段的类型是唯一的，它的应用是基于这样的一个理论：对于同一模板DNA，用同一引物扩增既可能得到相同的带谱〔模板基因组间可能具有同源性)，也可能得到不同的带谱。仅在某一特定模板中出现的条带就可作为该模板的分子标记。事实上，不同基因组DNA总是有一定差异的，所以用RAPD就可以进行分子标记研究。理论上讲，在一定的扩增条件下，扩增的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的引物，复杂性越高的基因组所产生的扩增条带数也越多。
RAPD所用的一系列引物的DNA序列虽然各不相同，但对于某一特定引物来说，它同基因组
DNA序列有特定的互补区域。这些特定区域在基因组的分布如果符合PCR扩增的反应条件的话，即引物在模板上的两条链如果有互补位置并且与引物的3’端在200bp以内，就可以扩增出这一片段。如果基因组在这些区域内发生插入、缺失、或者替换就可以导致这些特定的结合位置分布发生变化而使PCR产物发生增加、缺失、或者分子量发生改变，通过对PCR产物的检测，即可出基因组DNA在这些区域内的多态性。由于RAPD分析时所用的引物数量极大，并且引物序列随机，虽然对某一引物而言检测的区域有限，但是利用一系列引物可以检测的区域几乎可以覆盖整个基因组。其具体优点体现在:1，极大的丰富性，能反映整个基因组的变化。2.强大的可探测性，无需合成特定的引物。3.高效性与灵敏性。短期内可以得到大量的扩增片段，只要是遗传特异性的发生变化，即使亲缘关系很近的个体也可以识别出。RAPD最大的特点是引物的碱基序列是随机的，所用引物通常多达几百种，并且一套引物可以用作多个物种或者体，所以RAPD技术在用于遗传多样性和品种鉴定的研究中具有极大的优越性。因此用来鉴定品种纯度是很有用的。陈洪等(1996)利用OPP-18引物成功地鉴定了杂交水稻汕优63纯度，鉴定结果与田间小区种植鉴定完全一致。RAPD技术反应灵敏、多态性强，操作简便，速度快，费用低，既有大量的随机引物可供筛选之用，又不受种属的限制，被广泛用于多种作物的种子鉴定(方宣钧等1999, 2000)。并已经广泛的应用于遗
传作图、基因定位和克隆、物种进化及鉴定特殊染体区段的鉴别和分离，以及动植物育种等方面，特别是在寻与目的基因连锁的分子标记方面，近年来报道了大量的与各种目的基因连锁的RAPD标记。水稻的Xa-21基因和西红柿的pto基因的成功分离就是首先到了了与目的基因紧密连锁RAPD标记，然后通过定位克隆的方法克隆了目的基因。
随着RAPD日益厂泛的使用，其不足之处也逐渐显现，比如标记的显隐性位点性，致使其不能在后代中区分杂合体和纯合体；稳定性差，由于是单链引物随机的结合在众多的反向重复序列上，每次的实验结果可能不一致。解决办法是对单链引物进行筛选，优化PCR条件；高度的变异性，即使在亲缘关系很近的物种间，结果也可能差异极大；Tm值低的随机引物易受外界环境影响，如Mg2+浓度等。此外，RAPD技术是由多种成分参加的生化反应，反应中各种成分均为微量，尽管其反应灵敏度高，但是影响因素较多，故而RAPD受环境影响很大，稳定性差，重复性也不好，因此对实验的设备、条件及其操作的一致性很严格，这又大大限制了它的使用。为了得到较稳定的结果，各种反应参数必须事先优化选择，操作中每一步都必须小心谨慎，以防止出现差错。
1.2.2 扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism ,A F L P )
扩增片段长度多态性(AFLP)亦称选择性限制片段扩增(SRFA, Selective Restriction Fragment Amplification)，是荷兰Keygene公司Zabeau Marc和Vos Pieter于1993年创建的一种新型的分子标记。它的原理是基因组DNA双酶切，经PCR扩增后的限制性片段进行选择。其基本步骤是：先用两种限制性内切酶（一种为6碱基内切酶，如EcoRI，PstI等，另一种为4碱基内切酶，如Msel）对DNA进行酶切，然后在酶切片段上连上一个接头（adapter），根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，进行特异PCR扩增，扩增产物通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测。
AFLP结合了RFLP和RAPD的优点，稳定可靠，重复性好，方便快递，只需极少量的DNA样品，不需要Southern杂交，不需要预先知道DNA的序列信息，而且绝大部分为显性标记，显示的多态性信息量也很高。因此，非常换适合于品种指纹图谱的绘制，遗传连锁图的构建及遗传多样性的研究。Barrett等利用AFLP技术评价适应于西北太平洋旱地生产的春、冬小麦代表品种的遗传多样性，结果表明AFLP对小麦遗传多样性的研究来说是一种很有效地技术。美国康奈尔大学的Blair利用AFLP技术评价54份水稻品种的遗传多样性，研究其系统发育和分类，并与同工酶生化标记及RFLP标记比较，发现其结论一致，而且认为AFLP对于研究水稻品种的遗传变异和构建基因图谱更为理想。但这种方法需经多步操作，并且费用较高。

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