倒置相差显微镜及荧光显微镜的使用
摘要：倒置相差显微镜是相差显微镜与倒置显微镜的结合，能够在倒置的情况下观察到普通显微镜所不能清楚的观察的活细胞和未经染的生物标本，在细胞培养、显微操作技术等方面有了广泛的应用。荧光显微镜利用物质激发产生的微弱的荧光形成明亮的观察图像，在生物学以及医学的许多领域已经成为一种不可替代的观察和测试手段，能够精确的对生物标本中的特定组分、微量荧光染料进行分析研究。
关键词：倒置相差显微镜、荧光显微镜、使用
1.倒置相差显微镜及荧光显微镜的工作原理
1.1倒置相差显微镜的工作原理
在显微镜下镜检时，视场中的样品只有在反射光的波长（颜）和振幅（亮度）与周围介质有变化时，方能窥见被检样品。活的样品多为无透明，照明光线通过这种物体时，透过或反射光的波长和振幅都不发生改变，所以用普通光学显微镜难以辨清活体的结构。必须借助于固定和染等理化方法，使样品和背景的反射或透射光在波长和振幅上发生变化，即在颜和亮度centering
上有所差异，以供识别。
相差方法应用于生物学上的主要价值，在于它能对透明的活体进行直接观察，无需采用使细胞致死的固定和染的方法。染合活体以有害的影响，甚至失真。由此，才使相差法显得异常重要。
1.2 荧光显微镜的工作原理
荧光显微镜是利用一个高发光效率的点光源，经过滤系统发出一定波长的光(如紫外光365nm或紫蓝光420nm)作为激发光，激发检测标本内的荧光物质发射出各种不同颜的荧光后，通过物镜和目镜系统的放大以观察标本的荧光图像的光学显微镜，是医学检验中的重要仪器之一。
2.倒置相差显微镜及荧光显微镜的结构
2.1 倒置相差显微镜的结构
倒置相差显微镜是相差显微镜与倒置显微镜的结合，即具有倒置显微镜的倒置观察方式与同
相差显微镜相一致的成像原理。倒置相差显微镜的照明系统位于镜体上方，而物镜和目镜则位于下部。这样在集光器和载物台之间有较大的工作距离，可以放置培养皿、细胞培养瓶等容器，辅助以相差的光学系统，可以很方便地对培养中的细胞进行观察。
2.1.1 相差物镜（phase contrast objective）
相差物镜是显微镜特有的重要装置。在相差特镜内的后焦面上装有种类不同的相板。相板由于前述的作用，造成视场中被检样品影像与背景不同的明暗反差，各具不同的效果。因物镜内相板种类或构成的不同，物镜在明暗反差上可区分为两大类，即明反差（B）或负反差（N）物镜和暗反差（D）或正反差（P）物镜。物镜的反差类别，用英文字母B或N或D或P标志在物镜外壳上，并兼有高H（High）、中M(Medium)和低L（Low）等三种不同的反差。有的相差物镜用ph字样的标示。
同一反差类别的物镜，依放大率的不同，又可分为10×、20×、×40、和100×数种，因此，相关物镜种类颇多，一套可多达20余种。
相差物镜多为消差物镜或平场消差物镜（PL）。
2.1.2 转盘聚光器（turret condenser）
位于镜台之下，普通聚光器的所在位置上，由聚光镜和环状光阑（annular diapheragm）构成。环状光阑位于聚光镜之下，是一种特殊的光阑装置，由大小不同的环状通光孔构成，不同规格的通光孔——环状光阑装配在一个可旋转的转盘上，按需要调转使用。环状光阑的环宽与直径各不相同，与不同放大率的相差物镜内的相板相匹配，不可滥用。转盘前端朝向使用者一面有标示窗（孔），转盘上的不同部位标有0、1、2、3和4或0、10、20、40和100字样，通过标示窗显现。“0”表示非相差的明视场的普通光阑。1或10、2或20、3或40和4或100，表示与相应放大率的相差物镜相匹配的不同规格的环状光阑的标志。通过手动转入的标示窗内之数字，表示该数字所代表的环状光阑已进入光路。
2.1.3合轴调中望远镜（centering telescope）
合轴调中望远镜简称CT，又名合轴调中目镜。它是眼透镜，可行升降调节，具有较长的焦距的一种望远目镜。镜筒较长，其直径与观察目镜相同。它的功用仅作为环状光阑的环孔（亮环）与相差物镜相板的共轭面环孔（暗环）的调中合轴与调焦之用。相差显微镜使用时，转盘聚光器的环状光阑与相差目镜必须匹配，且环状光阑的孔环与相差物镜相板共轭面的环孔
在光路中要准确合轴，并完全吻合或重叠。以保证直射光和衍射光各行其路，使成像光线的相位差转变为可见的振幅差。但是，镜体的光路中前述两环的影像较小，一般目镜难以辨清，不能进行调焦与合轴的操作，非借助合轴调中望远镜不可。
2.1.4绿滤镜（green filter）
相差物镜的种类，从差消除情况来分，多属消差物镜（achromatic objective）或PL物镜。消差物镜的最佳清清晰范围的光谱区为510~630nm。欲提高相差显微镜的性能最好以波长范围小的单光照明，即接物镜最佳清晰范围的波长的光线进行照明。所以，使用相差物镜时，在光路上加用透射光线波长为500~600nm左右的绿滤镜，使照明光线中的红光和蓝光被吸收，只透过绿光，可提高物镜的分辨能力。该滤镜兼有吸热的作用，以利活体观察。
2.2 荧光显微镜的结构
2.2.1 光源
荧光显微镜具特殊光源（多为紫外光光源），提供足够强度和波长的激发光，诱发荧光物质
发出荧光。现在多采用200W的超高压汞灯作光源，它是用石英玻璃制作，中间呈球形，内充一定数量的汞，工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，球内气压迅速升高，当水银完全蒸发时，可达50～70个标准大气压力，这一过程一般约需5～15min。超高压汞灯的发光是电极间放电使水银分子不断解离和还原过程中发射光量子的结果。它发射很强的紫外和蓝紫光，足以激发各类荧光物质，因此为荧光显微镜普遍采用。但是超高压汞灯也散发大量热能。因此，灯室必须有良好的散热条件，工作环境温度不宜太高。
2.2.2滤系统
滤系统是荧光显微镜的重要部位，由激发滤板和压制滤板组成。滤板一般都以基本调命名，前面字母代表调，后面字母代表玻璃，数字代表型号特点。
2.2.3光学系统
荧光显微镜的光学系统主要由反光镜、聚光器、物镜、目镜、落射光装置组成。其中反光镜的反光层一般是镀铝的，因为铝对紫外光和可见光的蓝紫区吸收少。一般使用平面反光镜。 聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成，分为明视野聚光器、暗视野聚光器以及相
差荧光聚光器三种。在物镜的使用上，荧光显微镜各种物镜均可应用，但最好用消差的物镜，因其自体荧光极微且透光性能（波长范围）适合于荧光。由于图像在显微镜视野中的荧光亮度与物镜镜口率的平方成正比，而与其放大倍数成反比，所以为了提高荧光图像的亮度，应使用镜口率大的物镜。在荧光显微镜中，目镜经常使用双筒低倍目镜。
3.倒置相差显微镜及荧光显微镜的使用方法
3.1倒置相差显微镜的使用
现在实验室中使用的倒置相差显微镜一般是在普通倒置显微镜的基础上添加相差装置，因此在使用时需要注意相差装置与显微镜的配合使用。
1)相差装置的调换安装。卸下普通显微镜使用的聚光器，将环状光阑装在聚光器支架上，把绿滤光片放在上面，它可吸收红和蓝光，使波长范围小的单光线进行照明，并有吸热作用，能使相差观察获得良好的效果。再从转换器上旋下普通物镜，换上相差物镜。
2)调焦。打开光源，旋转集光器转盘，将“o”对准标示孔，使普通聚光器部分进进光路。先使用低倍相差物镜，按普通显微镜操纵方法进行对光和调焦。 旋转环状光阑，使光阑的直径和
孔宽与所使用的相差物镜相适应，如相差物镜为40 x时应用x40标示孔的光阑。
3)合铀调整。拔出目镜，插进合铀看远镜，一边从看远镜内内观察，并用左手固定其外筒；一边用右手转动看远镜内筒使其下降，当对准焦点就能看到环状光阑的亮环和相板的黑环，此时可将看远镜固定住。再升降集光器并调节其下的螺旋使亮环的大小与黑环一致，然后左右前后调节环状光阑聚光器上的调节钮，使两环完全重合，如亮环比黑环小而位于内侧时，应降低集光器使亮环放大；反之，则应升高聚光器，使亮环缩小。如若升到最高限度仍不能完全重合，则可能是载玻片过厚之故，应更换。合抽调整完毕，抽出看远镜，换回目镜，按常规要领进行观察。在更换不同倍率的相差物镜时，每一次都要使用相匹配的环状光阑和重新合抽调整。使用油镜时，集光器上透镜表面与载玻片之间要同时加上香柏油。
3.2 荧光显微镜的使用方法
1)打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮点。
2)透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的阻断滤片。落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插进所要求的激发滤片／双束分离器／阻断滤片的插块。
3)用低倍镜观察，根据不同型号荧光显微镜的调节装置，调整光源中心，使其位于整个照明光斑的中心。
4)放置标本片，调焦后即可观察。 使用中应留意：末装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤；用油镜观察标本时，必须用无荧光的特殊油镜；高压汞灯封闭后不能立即重新打开，需经5分钟后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。
4.结语
倒置相差显微镜和荧光显微镜凭借其较高的分辨率以及特殊的无可替代的用途为标本的观察翻开了新的一页，在病理学、显微操作技术等领域都有了广泛的应用，相信未来的发展过程中会有更好的前景。

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