实验⼆特殊显微镜的使⽤——相差显微镜
实验⼆特殊显微镜的使⽤
实验2.1相差显微镜
⼀、实验⽬的
掌握相差显微镜的原理、构造及其使⽤⽅法。
⼆、实验原理
相差显微镜（phase-contrast microscope ）是由P. Zernike 于1932年发明的，P. Zernike
于1953年获诺贝尔物理奖。相差显微镜最⼤的特点就是可以⽤于观察未经染⾊的标本和活细胞。
⼈们在光学显微镜下观察被检标本时，只有在反射光的波长（颜⾊）和振幅（亮度）与
周围介质有变化时，⽅能看到被检样品的结构。活细胞近于⽆⾊透明，光波通过时，透过或反射光的波长和振幅都不发⽣改变，所以⽤普通光学显微镜难以辨清活体的结构。⼀般对于明暗对⽐很⼩的样品，多借助于固定和染⾊等理化⽅法，使样品和背景的反射或透射光在波长和振幅上发⽣变化，即在颜⾊和亮度上
有所差异，才能识别。但有些样品⼀经染⾊就会引起变形，染⾊也可使有⽣命的样品死亡。我们可以利⽤相差
显微镜来进⾏观察。相差显微镜利⽤了光的⼲涉现象，将⼈
眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差，因此它是⼀种应
⽤在染⾊困难或不能染⾊的新鲜标本上获得⾼对⽐图像的新
型显微镜。
相差⽅法应⽤于⽣物学上的主要价值，在于它能对透明
的活体进⾏直接观察，⽆需采⽤使细胞致死的固定和染⾊的
⽅法。染⾊给活体以有害的影响，甚⾄失真。由此，才使相
差法显得异常重要。
相差是指同⼀光线经过折射率不同的介质其相位发⽣变
化并产⽣的差异。相位是指在某⼀时间上，光的波动所达到
的位置。相差决定于光波所通过介质的折射率之差及其厚度，等于折射率与厚度的乘积之差（即光程之差），介质越厚或折射率越⼤，光波减速也越⼤。
为了达到相差效应，在相差显微镜的物镜中，装有由光
学玻璃制成的相板（phase plate ）。在圆形相扳平⾯上，有⼀
圈与周围（⾥外）相扳厚度不同的或凸或凹的圆环。相板分
两部分：共轭⾯（conjugate area ）：通常为环状，是通过直射光的部分。其环是凸起的，也可能
是凹陷的。补偿⾯（complementary area ）：共轭⾯内外两侧部分，是通过衍射光的部分。在相板的共轭⾯或补偿⾯上，涂有改变光波相位或吸收光线的物质。当光线通过时，
使光波的相位或
图1-10 相差显微镜光路图
振幅改变，从⽽达到不同的⽬的与观察效果。利⽤相板把光波相位推迟，振幅改变。相板的
作⽤，除推迟直射光和衍射光的相位之外有吸收光，从⽽使亮度改变的作⽤。物镜的后焦点
位于透镜中间⽽相板位于物镜的后焦⾯上，所以相板安装在透镜中间。
相差显微镜的光路图如图1-12所⽰，光线从聚光镜下的环状光阑的圆形缝隙射⼊直射光，
照射到被检样品上，产⽣直射光和眼射光两种光波。衍射光的振幅较⼩，相位滞后。在物镜
的后焦⾯上，设有相板，直射光通过共轭⾯，衍射光通过补偿⾯，并相互⼲涉造像。样品的
影像由直射光和衍射光经⼲涉后的合成波造成；背景仅由直射光形成。由于直射光和衍射光
两种光波的相位差异不同造成不同的反差效果，或明反差或暗反差不等视所⽤物镜的相板类
别⽽定。成像光束由物镜射⼊⽬镜，在⽬镜的视场光阑处再次放⼤。
三、实验装置
相差显微镜不同于普通光学显微镜，在装置上有四种必不可缺的部件：相差物镜、具有
环状光阑的转盘聚光器、合轴调中望远镜和绿⾊的滤⾊镜。
1．相差物镜（phase contrast objective ）
相差物镜是显微镜特有的重要装置。在相差物镜内的后焦⾯上装有种类不同的相板。相
板由于前述的作⽤，造成视场中被检样品影像与背景不同的明暗反差，各具不同的效果。因
物镜内相板种类或构成的不同，物镜在明暗反差上可区分为两⼤类，即明反差（B ）或负反
差（N ）物镜和暗反差（D ）或正反差（P ）物镜。物镜的反差类别，⽤英⽂字母B 或N 和
D 或P 标志在物镜外壳上，并兼有⾼H （High ）、中M （Medium ）和低L （Low ）等三种不
同的反差。有的相差物镜⽤ph 字样标⽰。同⼀反差类别的物镜，依放⼤率的不同，⼜可分
为10×、20×、40×和100×数种，因此相差物镜种类颇多，⼀套可多达20余种。相差物
镜多为消⾊差物镜或平场消⾊差物镜（PL ）。
2．转盘聚光器（turret condenser ）
位于镜台之下，普通聚光器的所在位置上由聚光镜和环状光阑（annular diaphragm ）构
成。环状光阑位于聚光镜之下，是⼀种特殊的光阑装
置，由⼤⼩不同的环状通光孔构成，不同规格的通光
孔——环状光阑装配在⼀个可旋转的转盘上，按需要
调转使⽤（图1-13）。环状光阑的环宽与直径各不相同，
与不同放⼤率的相差物镜内的相板相匹配，不可滥⽤。
转盘前端朝向便⽤者⼀⾯有标⽰窗（孔），转盘上的不
同部位标有0、1、2、3和 4或 0、10、20、40、和
100字样，通过标⽰窗显现。“0”表⽰⾮相差的明视场
的普通光阑。1或10、2或20、3或40和4或100，
表⽰与相应放⼤率的相差物镜相匹配的相差物镜相匹
配的不同规格的环状光阑的标志。通过⼿动转⼊标⽰
窗内之数字，表⽰该数字所代表的环状光阑已进⼊光
路。
3．合轴调中望远镜（centering telescope ）
合轴调中望远镜简称CT ，⼜名合轴调中⽬镜。它是眼透镜，可⾏升降调节，具有较长
焦距的⼀种望远⽬镜。镜筒较长，其直径与观察⽬镜相同。它的功⽤仅作为环状光阑的环孔
（亮环）与相差物镜相扳的共轭⾯环孔（暗环）的调中合轴与调焦之⽤。相差显微镜使⽤时，
转盘聚光器的环状光阑与相差⽬镜必须匹配，
且环状光阑的环孔与相差物镜相扳共轭⾯的环图1-11 转盘聚光器构造图
孔在光路中要准确合轴，并完全吻合或重叠以保证直射光和衍射光各⾏其路，使成像光线的相位差转变为可见的振幅差。但是，镜体的光路中前述两环的影像较⼩，⼀般⽬镜难以辨清，不能进⾏调焦与合轴的操作，⾮借助合轴调中望远镜不可。
4．绿⾊滤⾊镜（green filter）
相差物镜的种类，从⾊差消除情况来分，多属消⾊差物镜（achromatic objective）或ＰＬ物镜。消⾊差
物镜的最佳清晰范围的光谱区为510~630nm。欲提⾼相差显微镜的性能最好以波长范围⼩的单⾊光照明，即接物镜最佳清晰范围的波长的光线进⾏照明。所以，使⽤相差物镜时，在光路上加⽤透射光线波长为500~600nm左右的绿⾊滤⾊镜，使照明光线中的红光和蓝光被吸收，只透过绿光，可提⾼物镜的分辨能⼒。该滤⾊镜有吸热的作⽤，以利活体观察。
四、实验步骤
相差显微镜的使⽤，较之普通显微镜要复杂些，但亦易于掌握，按下列过程进⾏操作。
1．相差装置的安装
如前所述，相差显微镜区别于普通光学显微镜的装置主要有相差物镜、转盘聚光器、合轴调中望远镜和绿⾊滤⾊镜四种部件。使⽤时将这些部件调换安装在同型号的普通光学显微镜上，即成为相差显微镜。
（1）相差物镜的调换安装
从物镜转换器上拆下普通物镜，旋⼊相差物镜，与普通⽬镜配套使⽤。
（2）转盘聚光器的调换安装
旋转聚光器升降螺旋，把普通明视场聚光器⾄最低位，旋松固紧螺丝，卸下聚光器。把转盘聚光器安放到相应位置上，旋紧固紧螺丝，转动聚光器升降螺旋，使聚光器升⾄最⾼位置。转盘聚光器的标⽰孔，朝向操作者。此时，转盘聚光器上⾯的聚光镜部分，进⼊光路；下⾯的环状光阑转盘，可视需要转动使⽤，把与物镜匹配的环孔旋⼊光路，使之处于转盘聚光镜下。
（3）把绿⾊滤⾊镜放⼊镜座的滤⾊镜架上。
2．聚光器调中
转盘聚光器调换安装后，要进⾏合轴调中，使聚光器的光轴与显微镜的主光轴合⼀。其步骤如下；
（1）把转盘聚光器的环状光阑调⾄“O”位，明视场照明⽤的普通可变光阑进⼊光路。
（2）旋转聚光器升降螺旋，聚光器升⾄最⾼位。
（3）接通照明光源，使视场明亮。
（4）把被检样品放到载物台上，⽤低倍（4×）物镜聚焦。
（5）缩⼩镜座上的视场光阑开孔，⾄最⼩。
（6）从⽬镜观察，在暗视场中可见⼀缩⼩的、明亮的、多⾓形的视场光阑图像。
（7）转动转盘聚光器的两个调中杆，推动聚光器，把视场中的明亮的多⾓形的视场光阑图像，调⾄视场中央。
（8）开放视场光阑⾄视场同⼤，视两者周边是否完全重合；否则，复⽤调中螺杆，使聚光器精确调中。
3．相板圆环与环状光阑圆环的合轴调中
centering
相差物镜的后焦⾯装有相板。按物镜放⼤率与反差效果的不同，相板圆环（共轭⾯）的⼤⼩与结构亦不同。转盘聚光器的环状光阑为⼀系列的透光的，不同⼤⼩的明亮环孔，与不同放⼤率的物镜相应。使⽤时严格匹配，当物镜更换时，环状光阑亦作相应的更换或调整。
在视场中观察所见，环状光阑为⼀明亮的圆环，⽽相板的圆环为⼀暗环。互相匹配的明环与暗环⼤⼩⼀致。在使⽤时两者要合轴，互相重叠。两环的重叠．须通过合轴调节⽅能取得。其⽅法如下：
（1）相差物镜与环状光阑的匹配：正确地匹配取决于所⽤物镜放⼤率。例如，当使⽤40×相差物镜时，环状光阑转向ph3或40位，使相应地环状光阑进⼊光路。
（2）把CT放⼊⽬镜筒：从⽬镜简取出⼀个⽬镜，换⼊调中合轴望远镜（CT）。CT 为⼀眼透镜，也是可⾏升降调节的望远⽬镜，专为观察视场中明环与暗环图像之⽤。因为⽤⼀般⽬镜着不见两环的清晰图像。CT在使⽤前眼透镜应处于最低位．即CT 为最短⼩的状态。
（3）明环与暗环的聚焦：⼀⼿固定位于⽬镜筒中的CT镜筒，使其场透镜位置不能上移，另⼀⼿逆时针转动CT上部可调的眼透镜部分。转动的同时，通过CT向现场中观察，即边旋转边观察。初始，两环可能为模糊的图像，继续转动CT⽬镜可调部分⾄清晰地窥见明环与暗环⽌。
（4）明环与暗环的调中重叠：相扳的暗环是固定不动的，处于光路之中，暗环的中⼼，即显微镜光轴的中⼼。环状光阑的亮环可调节移动。转盘聚光器环状光阑的位置，因聚光器的可调，其中⼼位置往往偏离光轴轴⼼，需调整，使其归中。环状光阑的调中装置或部件，因⼚家或型号的不同⽽有别。如OL YMPUS BH－PC型相差显微镜，环状光阑调中装置为位于转盘聚光器两侧的两个伸缩⾃如的调中螺杆，⽤以操纵改换环状光阑的⽅位，达到调中；⽽Nikon FIVOPHOT型显微镜的相差装置，其环状光阑的调中部件为位于转盘聚光器表⾯，可向任⼀⽅向滑动的环状钮。调中时，⼿捏调中装置，移动明环，使之与暗环合⼀。在两环调中过程，始终在通过CT的观察下进⾏。在调节过程中，如亮环⽐暗环⼩，并位于暗环内侧时，应降低聚光器位置，使亮环放⼤。若亮环⼤于暗环时，应提升聚光器，使亮环缩⼩，如聚光器已升⾄最顶点还不能完全重合可能是载玻⽚过厚之故。
（5）回装观察⽬镜：待相差物镜的暗环与环状光阑的亮环调中、重叠后，从⽬镜筒中取出CT，放回观察⽤的接⽬镜，以便镜检观察。

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