使⽤imagepro-plus测量荧光强度
使⽤imagepro-plus测量荧光强度
如今，使⽤荧光染料进⾏免疫组化染⾊的实验⾮常普遍，荧光染料染⾊细胞的荧光强度也能反映细胞中相关蛋⽩的表达强度，⾃然⽽然的，⼤家会想到是否可以通过IPP分析细胞或组织切⽚的荧光照⽚来分析其荧光强度，并以此来表⽰相应蛋⽩的表达强度。
⾮常令⼈沮丧的是，这个想法是很难实现的。这个⽹页详细说明了理由。
www.doczj/doc/9794bb5aa300a6c30d229f46.html /answers/showquestion.asp?faq=36&fldAuto=325
⾥⾯的结论是：You DON'T! Image Pro Plus can provide Intensity or Density measurements for any image. However, unless the image acquisitions system is properly calibrated, those numbers may not have any useful relationship with the real world. IPP的分析结果与实际情况是有很⼤误差的，这个误差不是IPP的错，⽽是在制作样品及拍摄照⽚的过程中引⼊的。
所以在介绍使⽤IPP分析荧光照⽚的⽅法之前，⾸先得说说如何拍摄荧光显微镜照⽚。这可能⽐IPP 的操作还要重要。
image pro plus
荧光显微镜拍摄的样品，是使⽤荧光染料染⾊的，使⽤荧光显微镜时最重要的，是选择合适的激发光滤光⽚与荧光滤光⽚。正确选⽤滤光⽚能得到⾜够强的荧光，但⼀般情况下，显微镜不可能配齐所有的滤光⽚，更何况现在的显微镜滤光⽚价格都很贵，只能求其次，使⽤波段相近的滤光⽚，荧光强度稍低⼀些。
粗略的选择是：
红⾊荧光染料，使⽤红⾊截⽌滤光⽚与绿⾊激发滤光⽚。
绿⾊荧光染料，使⽤绿⾊截⽌滤光⽚与蓝⾊激发滤光⽚。
蓝⾊荧光染料，使⽤蓝⾊截⽌滤光⽚与紫激发滤光⽚。
更精细的滤光⽚选择，可以参照下表：
www.doczj/doc/9794bb5aa300a6c30d229f46.html /jcyxy/zxlab/document/FluoDATA.xls
在拍摄荧光照⽚时，如果要分析荧光强度，与免疫组化照⽚⼀样，要确保每张照⽚的拍摄条件完全⼀致。先拿⼀张荧光最强的样品观察调整显微镜。确定相机拍摄的曝光时间。荧光照⽚的曝光要注意的事项有：
1.使荧光最强的部位不能曝光过度。判断标准是照出的照⽚在最亮处不能变⾊。⽐如绿⾊荧光照⽚，当曝光过度时，亮处会变成黄⾊甚⾄⽩⾊，这就是曝光过度了。过度的曝光会导致测量数值变低。当确定了⼀个曝光时间后，就必须以这个曝光时间拍摄所有的样品，绝不能使⽤⾃动曝光。
2.没有样品的空⽩部位应是纯⿊⾊。这⼀点不⼀定能作到。特别是组织切⽚，由于样品的散射作⽤，没有荧光的部位也会显⽰出⼀点荧光的颜⾊的。
3.荧光样品是有荧光淬灭效应的，当把样品放到载物台上后，要以最快的速度选择视野⽴即拍照。时间越长荧光越弱，其衰减速度与时间的指数相关。这就是导致荧光强度分析误差巨⼤的最主要原因。
4.使⽤激光共聚焦显微镜拍摄荧光照⽚⽐普通荧光显微镜效果更好，能够更有效地控制所有照⽚的拍摄条件保持⼀致。在条件可能时，尽量使⽤激光共聚焦显微镜来拍摄。
5.在拍摄细胞爬⽚上的细胞时，将爬⽚的细胞层向上，放置在载玻⽚上，然后再盖上⼀⽚⼲净的盖玻⽚。很多⼈喜欢把爬⽚翻过来放在载玻⽚上，直接在镜下观察，这样并不好。爬⽚背⾯沾的培养液不易擦净，导致图象不清晰。
6.许多情况下，在拍摄⼀张荧光照⽚后，还需在同⼀视野下拍摄⼀张细胞轮廓的普通光照⽚。由于没有进⾏正常染⾊，这不容易照清楚。有个绝招管⽤：将显微镜的普通光聚光镜往下降得很低，就能照出较清晰的细胞轮廓照⽚。
7.由于荧光实际上就是单⾊光，所以最好使⽤单⾊冷CCD作为拍摄相机拍摄12位或16位的灰度图⽚。不过⼀般的显微镜现在基本都是使⽤彩⾊CCD的。在设备可能的条件下，要拍摄12位或16位的图像。⽐如Olympus的DP70相机就可以拍摄这样的图⽚，图⽚⽂件会⼤⼀点，但对荧光照⽚的分析是⼤有好处的。
拍摄完图⽚之后，在分析之前，还需对图⽚进⾏⼀下转换处理。
荧光图⽚上，表达最强所对应的是图⽚上的亮处，背景则是⿊⾊的。这与免疫组化图⽚正好相反。所以要先把荧光图⽚作⼀个⿊⽩反相处理。IPP当然是可以作这件事的。其他的图象软件也都能作。如果使⽤IPP来Invert contrast，⼀定要记得Invert之后还要apply contrast⼀下，否则图⽚实际上是并没有改变的，它只是显⽰成了反相。反相后的照⽚另存到另⼀个⼦⽬录中⽤于
测量，原始照⽚是必须保留的。
这个反相的照⽚可以是彩⾊的，也可以是⿊⽩的。最好转换成⿊⽩的。
下⾯就可以测量荧光强度了。甚⾄⽅法还简单⼀些：在选⾊时，只需调整背景强度就⾏了。先测量⼀下没有荧光部分的灰度，⽐如测得背景值是240，那就在光密度校正中选择240作为背景，在HSI选⾊中只需考虑强度⽽不必考虑⾊彩，选择H：0-255、S：0-255、I：0-240。
如果阴性样品的荧光⾮常弱，常常会导致测量错误：图⽚上⼤量没有荧光的样品区域未被计⼊area 之中，
导致阴性样品的测量值偏⾼。此时需⼿动选择样品区域，然后测量这个区域的IOD与area，这样最后计算出来的mean density将是⼀个很⼩的数。
下⾯作个实例：
这三张照⽚，左边⼀张背景偏绿，中间⼀张曝光适当，右边⼀张则是曝光过度了。
荧光照⽚上经常会有⼀些明亮的杂点，这对于荧光强度的测量具有极⼤的⼲扰，它们必须被除掉。除去它们的⽅法很多。可以⾃⼰想办法。这⾥使⽤选⾊的办法。在选⾊窗⼝⾥要使⽤black on transparent显⽰⽅法，选择上那些亮斑点后就⾃然给填上⿊⾊了，然后点create preview image 按纽把图⽚照下来。
转成灰度图⽚。
还要作个⿊⽩反相Invert contrast 。反相后⼀定要再点⼀下apply contrast。
补充：其实那个菜单最下⾯的invert image就是直接反相图⽚的。点那个就⾏了。
先作光密度较正，如果荧光照⽚的背景纯⿊，0-255就⾏。
然后选择count/size的测量参数：测量IOD与area。
这张照⽚的细胞照得挺⼤，可以把area的过滤值选⼤⼀点，filter start为500，这样就有效排除掉了哪些⼩的杂质点。另外，还要在count/size的option中把fill holes选择给勾上。
对于灰度图⽚，选⾊窗⼝⾥只有强度⼀项选择，0-250就⾏了。当然，这个值要根据⾃⼰照⽚的情况来定，原则应是选择上所有的细胞。
点count进⾏测量，然后从view statistics 窗⼝中读取IOD SUM 及area SUM的数据。
mean density =（IOD SUM）/(area sum)
这就是这张照⽚上细胞的平均荧光强度值。
要保存count/size 及 segmentation两个窗⼝的setting file。在测量其他照⽚时，直接调⽤这两个设定⽂件⽽不必再次去调整那些测量参数。

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