多壁碳纳米管抑制 MC3T3-E1成骨细胞迁移的实验研究
罗明志;曾慧龙;潘艳;刘磊;邓林红;商澎
【摘 要】Objective To assess the influence of multiwalled carbon nanotubes (MWCNTs) on migration of MC3T3‐E1 osteoblasts .Methods Ultrasound was used for MWCNTs .The morphology and size of the dispersed MWCNTs were detected by scanning electron microscopy , transmission electron microscopy and dynamic light scattering (DLS) .MC3T3‐E1 cells were treated with MWNCTs (100 μg/mL) ,and the morphology of MC3T3‐E1 cells were detected with atomic force microscopy .Cell migration was measured with wound healing methods ,and the property of cell migration was analyzed by Gradientech Tracking software .Results MWCNTs were well dispersed , and absorbed to the surface of cells after exposure for 12 h .The wound healing assay showed that the wound healing rate after 12 h was 45% for MWCNTs treated MC3T3‐E1 cells versus 80% for non‐treated controls(P<0 .01) .The distance ,direct distance and cell motility velocity of MC3T3‐E1 cells also reduced similarly due to the presence of MWCNTs .Conclusion MWCNTs absorb to the surface of MC
3T3‐E1 cells and significantly inhibit the migration of osteoblasts .%目的探讨多壁碳纳米管（MWCNT）对MC3T3‐E1成骨细胞迁移的影响。方法采用超声法分散 MWCNT ，经扫描电镜、投射电镜和动态光散射仪检测分散效果。采用 MWCNT （100 g／mL）处理MC3T3‐E1成骨细胞，原子力显微镜检测细胞表面形态，划痕实验检测细胞迁移情况，Gradientech Tracking软件分析细胞迁移特性。结果 MWCNT获得较好分散，细胞处理12 h后， MWCNT大量吸附于细胞表面。划痕实验显示对照组愈合率为80％，MWCNT处理组愈合率为45％（P＜0．01），其迁移距离、直线距离和迁移速度均显著低于对照组。结论 MWCNT可大量吸附于成骨细胞表面并显著抑制M C3 T 3‐E1成骨细胞迁移。
【期刊名称】image pro plus《国际骨科学杂志》
【年(卷),期】2015(000)003
【总页数】4页(P194-197)
【关键词】多壁碳纳米管;成骨细胞;迁移;微丝
【作 者】罗明志;曾慧龙;潘艳;刘磊;邓林红;商澎
【作者单位】710072 西安，空间生物实验模拟技术国防重;710072 西安，空间生物实验模拟技术国防重;710072 西安，空间生物实验模拟技术国防重;710072 西安，空间生物实验模拟技术国防重;710072 西安，空间生物实验模拟技术国防重;710072 西安，空间生物实验模拟技术国防重
【正文语种】中 文
碳纳米管（CNT）独特的力学及化学性质使其在材料、信息、能源及生物医学等领域都有巨大的应用价值［1－3］。随着CNT的广泛应用，其生物安全性也引起广泛关注［4］。CNT进入人体后在体内驻留时间长达90 d。有研究［5］表明，CNT可诱导小鼠肺部炎症和纤维化。CNT进入人体后会在骨组织富集，而在大量骨组织工程材料中加入CNT［6］，可增加其力学性能，但CNT对成骨细胞功能的影响有待进一步研究［7］。
基于多壁碳纳米管（MWCNT）的刚性特性，它吸附至细胞膜表面必将影响细胞膜刚度和流动性，从而改变细胞生物力学特性。而细胞运动过程涉及细胞骨架重构和细胞膜流动，细胞生物力学特性对该过程具有重要影响。因此，本实验中我们假设MWCNT吸附可影响细胞的迁移特性，研究MWCNT分散方法，并通过原子力显微镜和划痕实验探究MWCNT分散对成
骨细胞吸附及细胞迁移的影响。
1 材料与方法
1.1 MWCNT分散
MWCNT购自南京先丰纳米材料科技有限公司，直径8～15 nm，长度50 m。采用扫描电镜观察MWCNT未分散时的形态及其元素组成和含量，采用含0.6%牛血清白蛋白（BSA）的最低营养培养基（MEM）悬浮 MWCNT，采用超声波细胞破碎仪（40 W）超声分散 MWCNT5 min（超声分散3秒，间隔3秒），采用动态光散射仪和投射电镜评价其分散情况。
1.2 细胞培养
将小鼠MC3T3－E1成骨细胞（购自中国科学院上海细胞库）培养于含10%胎牛血清（FBS）（美国Hyclone公司）、双抗（青霉素、链霉素，100 IU／mL）的MEM培养基中，置于含5%CO2、饱和水蒸汽的培养箱（37℃）中培养。
1.3 划痕实验
收集 MC3T3－E1细胞，以8×104个／cm2接种至六孔板，12 h后用白头划线，磷酸盐缓冲液洗涤3次后添加MEM，加入MWCNT分散液（终浓度100 g／mL）后置入活细胞工作站（德国Leica公司）培养，每隔5 min拍照。随机选取30个细胞，用Gradientech Tracking分析系统对MC3T3－E1细胞的迁移距离、速度和方向进行分析。
1.4 原子力显微镜观察
采用轻敲模式原子力显微镜（德国JPK公司）在空气中对细胞进行扫描。初始扫描范围为100 m×100 m，然后缩小扫描范围至10 m×10 m，观测细胞表面的微观结构，记录原子力显微镜三维图。
1.5 统计学分析
全部数据采用Prism5.0统计学软件进行统计分析，结果以均数±标准差表示，采用t检验比较实验组与对照组之间差异，以P＜0.05为有统计学意义。
2 结果
2.1 MWCNT分散及表征
采用扫描电镜观察 MWCNT粉体（图1a）纯度、长度和宽度等基本参数，能谱分析结果显示MWCNT的主要元素为碳和氧，含量达95%（表1），直径15 nm，长度为50 m（图1b）。将经超声波处理的MWCNT分散液放置于4℃环境中2周，结果无明显沉淀（图1c），动态光散射仪检测结果为（180.20±16.23）nm。投射电镜观察发现 MWCNT分散较好，但其长度明显变短（图1d）。
表1 MWCNT扫描电镜能谱分析结果?
图1  MWCNT颗粒及其分散后的形态 a、b.未分散的MWCNT c.MWCNT分散液 d.分散的MWCNT
2.2 MWCNT对细胞迁移的影响
采用划痕实验检测MWCNT对成骨细胞迁移的影响，光学显微镜（×10）观察发现与对照组相比，MWCNT处理组划痕区域迁入细胞较少（图2a～2d）。采用Image Pro Plus 6.0软件对其空白区域面积进行分析，结果显示对照组愈合率为80%，而MWCNT处理组愈合率为45%（P＜0.01）。
图2 采用划痕实验检测MWCNT对成骨细胞迁移的影响，光学显微镜观察对照组、MWCNT处理组在0h（a、b）和12 h（c、d）时的细胞迁移（标尺＝100 m）
采用Gradientech Tracking软件对细胞的迁移特性进行分析，结果显示与对照组相比（图3a），MWCNT处理组细胞迁移距离明显较少（图3b），其迁移距离从 172.52 m 下降至 129.80 m（P＜0.01），直线距离从（88.50±11.65）m 下降至（55.20±8.50）m （P ＜ 0.01），迁 移 速 度 从0.3 m／min下降至0.2 m／min（P＜0.01），差异均有统计学意义。
2.3 MWCNT对成骨的吸附特性
MWCNT处理 MC3T3－E1成骨细胞12 h后，原子力显微镜观察细胞表面形态，结果显示细胞表面依然吸附大量的MWCNT（图4）。
图3 采用Gradientech Tracking软件分析细胞迁移特性，对照组（a）与 MWCNT处理组（b）细胞迁移轨迹
图4 原子力显微镜检测MWCNT对成骨细胞的吸附作用 a.对照组 b.MWCNT处理组
3 讨论
体内外实验研究［8－9］表明，MWCNT 的分散特性对其生物学效应具有根本性影响。用于细胞实验的MWCNT分散方法是目前研究的热点，基础培养液、完全培养基、表面活性剂等被用于分散MWCNT［10－11］。本实验采用含0.6%BSA 的完全培养基分散MWCNT，动态光散射仪和投射电镜观察显示分散效果较好，但投射电镜观察发现分散后MWCNT长度为1 m以下，提示超声分散可显著降低MWCNT长度。
MWCNT对成骨细胞的影响已有报道［12］。研究表明，在未修饰的MWCNT表面可直接培养细胞［13］，在细胞外基质或组织工程支架材料中添加MWCNT可促进成骨细胞分化和骨损伤修复［14］。但溶液中分散的MWCNT对成骨细胞迁移特性的影响研究少见报道。本实验研究发现，100 g／mL的MWCNT可显著抑制成骨细胞迁移，进一步分析显示细胞迁移距离降低，迁移速度下降。
MWCNT对细胞毒性作用的机制已有大量报道，其中氧化应激机制是其重要途径，但也有研究表明MWCNT对细胞的吸附可能也会影响细胞的生理功能。CNT可诱导肿瘤细胞原癌基因c－Myc表达，从而抑制ABC转运蛋白表达，但这种作用可能不是通过氧化应激发生作用，而是通过与细胞膜相互作用引起［10］。有研究［15］表明，MWCNT 可引起细胞骨架解聚，
导致细胞膜重构。在本实验中，MWCNT大量吸附于细胞表面，而CNT可改变细胞膜刚度［16］，因此我们推测 MWCNT可能通过吸附作用改变细胞生物力学特性，从而影响细胞迁移，但具体机制有待进一步研究。
参考文献
【相关文献】
［1］ Tsukahara T，Matsuda Y，Usui Y，et al.Highly purified，multi－wall carbon nanotubes induce light－chain 3B expression in human lung cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2013，440（2）：348－353.
［2］ Pryzhkova MV，Aria I，Cheng Q，et al.Carbon nanotube－based substrates for modulation of human pluripotent stem cell fate［J］.Biomaterials，2014，35（19）：5098－5109.

版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。