心肌纤维化病理染鉴定方法的综合评价
吴限;黎明江;李莎
【摘 要】目的 观察比较苏木精-伊红染法(hematoxylin and eosin staining,HE staining)、Masson染法和-天狼猩红染法(picric sirius red staining,PSR staining)在评价心肌纤维化的各自特征及优缺点.方法 20只SD大鼠予以盐酸异丙肾上腺素(isoprenaline,IS0)制备心肌纤维化模型,以5mg/(kg·d)于同一时间段注射,持续3周.取大鼠心脏组织行HE染、Masson染以及PSR染,置于显微镜下观察纤维化面积及胶原沉积特点,并比较Masson染和PSR染纤维化面积所占心肌总面积比重.结果 3种染方法均可显示心肌纤维化面积,Masson染和PSR染所示纤维化面积差异无统计学意义(P＞0.05);PSR染后进一步行免疫荧光染能够明确区分Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维的表达,然而Masson染和HE染则不能区分.结论PSR染法结合免疫荧光技术较Masson染法和HE染法,能够更好的评价心肌纤维化程度及胶原纤维类型,对于心肌纤维化的及预防具有重要意义.%Objective To compare hematoxylin and eosin(HE) staining,Masson's staining and picric sirius red(PSR) staining in evaluation of cardiac fibrosis.Methods Twenty adult sprague dawley (SD) rats were given subcutaneous injection o
f isoprenaline for 5mg/(kg · d) for 3 weeks,which induced cardiac fibrosis model successfully.In order to observing the fibrotic areas and collagen deposition,we prepared paraffin sections by using the heart specimen of rat,and carried out HE staining,Masson staining and PSR staining respectivelly for the special staining.Results All staining methods could clearly show the collagen fibers and fibrosis stage.We could clearly distinguish the type Ⅰ and type Ⅲ collagen fibers through PSR staining with immunoflurescent techniques,but not Masson and HE staining.Conclusion The results demonstrated that PSR staining is better than HE and Masson staining to be used for the evaluation of degree and type of proliferation of collagen fibers.It has important signification for treatment and prevention of cardiac fibrosis.
【期刊名称】《医学研究杂志》
【年(卷),期】2017(046)009
【总页数】4页(P34-37)
【关键词】心肌纤维化;胶原蛋白;Masson染;PSR染
【作 者】吴限;黎明江;李莎
【作者单位】430060 武汉大学人民医院心内科、武汉大学心血管病研究所、心血管病湖北省重点实验室;430060 武汉大学人民医院心内科、武汉大学心血管病研究所、心血管病湖北省重点实验室;430060 武汉大学人民医院心内科、武汉大学心血管病研究所、心血管病湖北省重点实验室
【正文语种】中 文
【中图分类】R541.9
目前，心肌纤维化是一个全球性的难题，是多种急慢性心肌损伤的终末期病理表现，几乎涉及所有心血管疾病的发生、发展过程[1]。心肌纤维化的病理改变包括心腔扩大，室壁变薄，心肌细胞肥厚及凋亡，长期发展可逐步演变为充血性心力衰竭甚至因恶性心律失常诱发猝死，故遏制心肌纤维化是防治心血管疾病及改善其预后的重要侧重点之一[2，3]。心室重塑是心肌纤维化的首要特征，主要表现为各种胶原成分比率改变，细胞外基质的合成与降解失衡。其中，胶原蛋白是心肌细胞外基质的重要构成部分。心肌胶原共有5型，在心脏以Ⅰ型和Ⅲ型为主，Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白在总胶原蛋白中所占的比例各自为80%和11%。
Ⅰ型胶原蛋白有较大的抗牵拉性用于保持室壁的强度，而Ⅲ型胶原具有较强的伸展性和弹性，主要与心室肌有效收缩及泵血功能有关[4]。Linthout等[5]的研究表明糖尿病大鼠心肌组织中Ⅰ型和(或)Ⅲ型胶原蛋白在间质中的交联、沉积会导致心肌顺应性降低，室壁僵硬度增加，从而促进心力衰竭的发生与维持。此外，大量的研究表明心肌纤维化是多种疾病促发及进展的病理生理机制。因此近年来心肌纤维化的早期诊断得到了越来越多科研人员和临床医师的关注及重视。Masson染法和PSR染法是胶原纤维的常用特殊染方法，上述特殊染多用于HE染的补充诊断[6，7]。然而对于心肌纤维化病理改变中一些难以观察或观察不到的组织成分，或者是组织细胞内所含的某些物质普通染难以鉴定。故特殊染方法有利于实验人员了解心肌纤维化中特殊物质在标本中的分布、含量及性状的变化，从而使我们更深入的了解心肌纤维化组织、细胞的生理或病理改变机制[8]。本实验从上述角度出发，通过比较不同病理染方法的优缺点，希望为基础研究实验动物模型制备的判定乃至临床心肌纤维化的诊疗提供新的方向。
1.模型制备:20只SD清洁级雄性大鼠，180～200g，由湖北省疾病预防及控制中心实验动物部门提供。大鼠分笼饲养，每笼5只。饲养温度为 22～25℃，相对湿度保持在50%左右。所有大鼠均给予标准饲料、自由进食水。20只SD大鼠腹腔注射ISO制备心肌纤维化模型，以5
mg/(kg·d)于每一天的同一时间段注射持续21天。最后1次用药结束后停药观察3～4天，随后处死大鼠并取出心脏组织。甲醛溶液固定并石蜡包埋，取部分左心室心肌行HE染、Masson染以及PSR染；另取部分心肌组织行免疫荧光染进行分析。
2.HE染：将浸好蜡的组织置于包埋机内进行包埋，修整好的蜡块置于石蜡切片机上进行切片，切片后放入摊片机内40℃温水将组织摊平，于60℃烤箱烘干；石蜡切片脱蜡至水，切片入Harris苏木素染3～8min,自来水冲洗，1%的盐酸酒精分化数秒后水洗，0.6%氨水反蓝，流水冲洗；切片入伊红染液中染1～3min；将切片从二甲苯中拿出后稍晾干，中性树胶封片。
3.Masson染：石蜡切片脱蜡置水，置于重铬酸盐-醋酸液处理40min，水洗后染苏木精10min,自来水冲洗；2%的盐酸酒精分化，继续用水冲洗；1%的丽春红酸性品红液中染15min，蒸馏水冲洗；1%磷钼酸水溶液处理5min，接着用2%的亮绿液染8min；1%的醋酸液分2～3次，脱水、透明、中性树胶封片。
4.PSR染：石蜡切片脱蜡至水后，将水洗过的切片放入天狼星红染液中浸染1.5h。随后流水冲洗5min，蒸馏水稍洗。再将切片置入Harris苏木素染3～8min，流水冲洗；1%的盐酸酒
精分化数秒，继续冲洗；0.6%氨水返蓝，再次冲洗。依次脱水、晾干、最后中性树胶封片。
5.免疫荧光：石蜡切片脱蜡至水后用PBS洗3次，每次5min。切片置于EDTA缓冲液中微波修复，中火至沸后断电，间隔10min低火至沸。自然冷却后PBS洗3次，每次5min。切片置于3%过氧化氢溶液中，室温下避光孵育10min。PBS洗3次，每次5min，甩干后5% BSA封闭20min。去除BSA液，每张切片加入约50μl稀释的一抗覆盖组织，PBS洗3次，每次5min。去除PBS液，每张切片加50～100μl相应种属的二抗，37℃孵育50min。PBS洗3次，每次5min。去除PBS液，每张切片加50～100μl DAPI染液，室温避光孵育5min。染后将切片放入PBS中洗3次，每次5min。滴加适量的抗荧光淬灭剂于组织上，中性树胶封片，置于显微镜观察并拍照。
6.判定结果：病理染切片分别置于显微镜下观察造模组纤维化程度及胶原纤维分布情况，每张切片分别选取6～8个不重复视野并于高倍镜下拍照，应用Image-Pro plus 6.0图像分析软件计算胶原纤维在整个心肌面积中所占百分比。Masson染切片中红为正常心肌组织，蓝为胶原蛋白；PSR染切片中黄为正常心肌组织，而红则为增生沉积的胶原纤维。在免疫荧光切片中，Ⅰ型胶原为红荧光、Ⅲ型胶原为绿荧光。
7.统计学方法：应用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差表示,两组间比较采用配对样本t检验,3组及多组间比较采用单因素方差分析，同时间组间比较采用LSD或SNK法，以P<0.05为差异有统计学意义。image pro plus
1.动物模型:20只SD大鼠在饲养过程中因药物不良反应死亡2只，因注射部位皮肤溃烂咬伤致死2只，因急性心力衰竭死亡1只，最终符合标准的实验动物共15只。
2.光镜观察结果:HE染显示正常心肌组织及血管周围有大量纤维结缔组织生成，心肌间质胶原数量明显增多、增粗，纤维结缔组织紊乱松散呈网格状；另外可见心肌间质中大量炎性细胞浸润及成纤维细胞增殖(图1中A、B)；而正常心肌间质胶原纤维数量少、分布规则，心肌细胞排列整齐、致密、心肌肌束形态完整。在HE染的基础上，显微镜下观察Masson染和PSR染结果。Masson染显示造模组大面积纤维化组织替代正常心肌组织，心肌间质胶原明显增生，大量蓝染的纤维结缔组织呈网格状将心肌肌束分隔包饶(图1中C、D)。PSR染示大量被染成红的胶原纤维蛋白，胶原蛋白数量明显增多，而正常心肌组织呈黄(图1中E、F)。上述3种染方法均能较好的显示心肌纤维化形态及纤维蛋白沉积，但Masson染法和HE染法不能区分Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白。随后比较Masson染法和PSR染法纤维化面积的差异，据图2可知两种染方法纤维化面积差异无统计学意义(P>0.05)。
3.免疫荧光：经PSR染的病理切片进一步行免疫荧光染，能够清楚的显示Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维，而且Ⅰ型胶原纤维的表达明显多于Ⅲ型胶原纤维，病变越严重，纤维化程度越高， Ⅰ型胶原沉积越多(图3中A、B、C)。然而 Masson染法和HE染法则不能够反应出上述特征。
随着全球老龄化步伐的加剧，心血管疾病已上升为威胁人类健康的主要病种之一，严重影响着国家经济水平的提高和居民生活质量的改善。心肌纤维化是包括高血压、瓣膜性心脏病、扩张型和肥厚型心肌病以及糖尿病性心肌病等在内的多种心血管疾病的终末期表现，也是心室重塑的主要形式之一[9～13]。在早期阶段，纤维结缔组织的代偿性增生有助于平衡心肌肌束的收缩及舒张，以维持泵血功能的稳定；但随着压力负荷、容量负荷以及多种神经体液因素的长期刺激，大量胶原蛋白交联并沉积于心肌间质，使心肌功能缓慢丧失，逐步发展为充血性心力衰竭。因此发现早期有效的检测心肌纤维化手段是必须且急迫的。目前针对心肌纤维化的检测方式多种多样，包括血清胶原纤维特异性标志物、超声心动图、核医学显像、心内膜组织活检以及磁共振成像等，然而病理学检测仍旧是心肌纤维化诊断的金标准。有文献指出尸检和心内膜心肌活检是临床诊断心肌纤维化最准确的方法[8]。
ISO属于儿茶酚胺类物质，通过非选择性的兴奋心肌细胞上的β受体，激活交感神经系统，引起组织细胞儿茶酚胺的产生及释放，使血液循环中儿茶酚胺及缩血管物质浓度升高。外源性注射ISO促使机体生物活性物质的大量释放，破坏了心肌细胞的氧供平衡。心肌细胞的损伤可引起心肌组织缺血缺氧，造成促凝及抗凝凝血机制紊乱，最终致使心肌及血管内皮细胞的凋亡、坏死，导致纤维化的发生。以上即为ISO诱导在体动物心肌纤维化模型的经典理论，因此可以肯定通过腹腔注射ISO诱导心肌纤维化模型的这一方法是正确的。再者，本实验造模结果与Seeland等[14]实验结果一致。因此有充分的理论依据支持该造模方法的切实性和可行性。

版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。