重组胶原蛋白经皮渗透、紧致、修复的
体外研究
冯丽萍 范婷
（江苏江山聚源生物技术有限公司，江苏泰州214500）
胶原蛋白来源方式中，合成生物学与传统动物中提取方式相比，独特优势在于避开病毒携带隐患、批次重现性差、目标蛋白难分离的问题，而且合成生物学的生产效率比较高。重组胶原蛋白是近年来合成生物学的产物之一，是将胶原蛋白的DNA序列体外合成后导入不同宿主（微生物、动物、植物）通过发酵、分离纯化获得重组胶原蛋白[1]。
药物经皮给药目的是利用皮肤给药全身性疾病，药物经历三个阶段：一是经皮渗透，即透过表皮进入真皮。二是皮肤吸收，即在真皮通过毛细血管作用进入体循环。三是在作用部位聚集，即化妆品功能性成分作用于皮肤表面或进入表皮或真皮，并在该部位积聚和发挥作用。例如，美白产品中的美白剂常作用于表皮中的基底层，阻断黑素的产生；而抗衰老产品的功效成分则常作用于真皮层的成纤维细胞，使皮肤富有弹性[2]。
《化妆品安全评估技术导则（2021 年版）》指出，当分子量大于1000道尔顿时，可以不考虑透皮
吸收。但本文通过离体皮肤实验证明了，55000道尔顿的重组胶原蛋白仍然能经皮渗透。
一、材料与方法
（一）试剂与材料
测试模型：选离体皮肤作为测试模型（广东博溪生物科技有限公司）。
试剂：PBS缓冲溶液（索莱宝）、4%多聚甲醛组织固定液（Biosharp）、Hoechst（碧云天，C1022）、Phalloidin（碧云天，C2203S）、离体皮肤组织培养液（FSK4，广东博溪生物）、维生素C （Sigma）、维生素E（Sigma）、多聚甲醛（国药）、PBS（索莱宝）。
设备：CO2培养箱（Thermo，1501）、超净工作台（苏净安泰，SW-CJ-1F）、莱卡生物显微镜（DM2500LED）、正置显微镜（Olympus，BX53）。
样品：重组胶原蛋白（PA2190S001 江苏江山
摘要：采用荧光标记重组胶原蛋白，涂抹于体外培养的离体皮肤，经过荧光显微观察，离体皮肤基底层下方（真皮层）可观察到荧光信号，说明重组胶原蛋白经皮渗透深度可达到真皮层。从荧光强度数据对比发现，8h内随着时间加长，荧光强度值增加，说明到达真皮层重组胶原量在增加。为了探究渗透后重
组胶原蛋白的作用机理，对离体皮肤进行紫外处理后涂抹样品，检测皮肤组织的组织形态、胶原纤维、弹性纤维、Collagen IV蛋白含量的变化，发现重组胶原蛋白具有紧致、修复功效。
关键词：重组胶原蛋白；经皮渗透；紧致；修复
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聚源生物技术有限公司）白固体可水溶的样品。（二）组织处理方法
首先进行组织处理，即将新鲜获得的皮肤组织浸入75%酒精中，清洗30s，再使用无菌的PBS缓冲液清洗3次；结束后，用一次性无菌皮肤取样器将皮肤组织切成直径为0.8cm的小圆片，表皮面向上，真皮面向下，放入培养模具中，然后将培养模具转入6孔板中，每孔加入3.7mL培养液，在37℃
的5%CO2孵箱中培养。然后，再进行测试。（三）测试步骤
1.经皮渗透测试。（1）测试方案。将FITC标记后的重组胶原蛋白配置成0.06%的给药浓度，涂抹于离体皮肤，分别于0h、4h、8h取组织样本，切片、染、荧光显微镜观察。（2）渗透能力测试。离体皮肤组织培养1天后，将装有离体皮肤组织的小室移入新的6孔板中，给每孔中加入0.9mLPBS。（3）给药。每个样品的每个时间点设置3重复。用移液吸取10μL配制好的0.06%FITC 标记样品，涂抹至离体皮肤组织表面，分别于0h、4h、8h时间点采集离体皮肤组织样本，浸于4%多聚甲醛溶液中固定（固定时间≥
24h）。冷冻切片，待用。（4）细胞骨架及细胞核染。细胞骨架染，将Phalloidin 按照1∶100的比例稀释使用，每张切片上滴加Phalloidin工作液200μL，避光孵育60min，用含0.1%TritonX-100的PBS洗涤3次，每次5min。细胞核染，取2μL的Hoechst原液加入1mLPBS 中，配制成Hoechst工作液。每张切片上滴加Hoechst工作液100μL，避光孵育10min，PBS清洗3次，每次5min，封片待用。（5）结果分析。应用GraphPad Prism做图，结果表示为Mean±SD，各组间比较采用t-test统计分析，统计分析均为双尾。P<0.05认为具有显著差异，P<0.01认为具有极显著差异。
2.紧致、修护体外测试。（1）测试方案。4个样品组分别为空白对照组（BC）、阴性对照组（NC）、样品组重组胶原蛋白0.05%、样品组重组胶原蛋白0.2%，将样品作用于离体皮肤组织表面，空白对照组不做处理；阴性对照组和样品组用30 J/cm2 UVA+50mJ/cm2 UVB紫外诱导后，观察离体皮肤的组织形态、胶原纤维、弹性纤维、Collagen IV的变化。（2）给药及刺激。离体皮肤组织培养2天后，按照测试方案进行试验分组及相应处理条件，开始进行UV辐照和给药；UV照射剂量为UVA（30J/cm²）和UVB（50mJ/cm²），连续辐照4天，每次辐照完后更换新鲜培养液，并进行给药处理，样品采用表面给药（2pL）的方式进行。连续辐照4天后，将离体皮肤组织继续培养3天，在此期间不进行UV刺激，只进行样品给药。（3）组织形态测试。给药结束后的皮肤组织采用4%多聚甲醛固定模型，组织包埋，切片后进行H&E染，回收切片结果，使用显微镜拍照，使用Image-Pro8 Plus图像处理软件进行分析。（4）胶原纤维、弹性纤维测试。给药结束后的皮肤组织采用4%多聚甲醛固定模型，组织包埋，切片后分别进
行Masson染和维多利亚蓝染，回收切片结果，使用显微镜拍照，使用Image-Pro8 plus图像处理软件进行分析。（5）Collagen IV含量测试。给药结束后的皮肤组织采用4%多聚甲醛固定模型，组织包埋，切片后根据免疫组化检测步骤，开展免疫组化染，使用Image-Pro8Plus图像处理软件进行分析。（6）数据处理分析。采用经皮渗透测试结果分析的方法。
二、结果与分析
（一）经皮渗透测试
1.荧光显微观察结果。重组胶原蛋白的荧光显微观察结果见表1。图中蓝是被Hoechst染的细胞核，蓝下边缘是基底层。红是被Phalloidin 染成的细胞骨架，主要位于是皮肤角质层和表皮层，少量位于真皮层。绿是FITC荧光，显示重组胶原蛋白渗透结果。渗透4h后，绿荧光在真皮层可被观察到，说明重组胶原蛋白渗透到真皮层；渗透8h 后，真皮层荧光强度显著性增加。
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2.荧光强度数值汇总结果。重组胶原蛋白的真皮层荧光强度数值见表2，表皮层荧光强度数值见表3。通过对表2、表3中的数据分析可知，8h 内，随
表1 重组胶原蛋白不同染料染荧光显微观察结果
着时间的延长，表皮层和真皮层的荧光强度值都在增加。这说明，8h 内渗透量随着时间的延长在不断增加。
表2 真皮层荧光强度数值汇总
表3 表皮层荧光强度数值汇总
测试分组
时间点
光密度值
Mean
SD
Pvalue
（vs 上一时间点）
Repl
Rep2Rep3Oh
4309.23837.25300.34482.2746.8/1#
重组胶原蛋白
4h 50219.332267.040867.641118.08978.70.002**8h
130833.5
120467.7
105380.1
118893.7
12799.5
0.001**
测试分组
时间点
光密度值
Mean
SD
Pvalue
（vs 上一时间点）
Repl
Rep2Rep30h
3680.03273.03183.03378.7264.8/1#
重组胶原蛋白
4h 25400.123343.027726.125489.72192.90.000***8h
48626.5
40772.8
41453.7
43617.7
4351.1
0.003**
备注：组间比较采用t-test 统计分析，所有统计分析均为双尾。P<0.05被认为具有显著性差异，P 值越小，差异越显著。*表示每个样品后一个时间点与前一时间点的显著性，**表示P<0.01，***表示
image pro plusP<0.001）
（二）紧致、修护体外测试
对照组、样品组处理离体组织，然后经过紫外
诱导后，观察离体皮肤的组织形态、胶原纤维、弹
性纤维、Collagen IV的变化，评估样品的紧致、
修复效果。
1.组织形态测试结果。培养结束后对组织模型
2.胶原纤维测试结果。培养结束后对皮肤组织
进行胶原纤维测试，具体结果汇总见表5、表6。与
空白对照组相比，阴性对照组的胶原纤维含量显著
下降，说明本次测试刺激条件有效。与阴性对照组
相比，样品重组胶原蛋白 0.05%、重组胶原蛋白0.2%
表4 组织形态结果汇总
表5 皮肤组织胶原纤维含量的变化情况
进行H&E染，结果汇总见表4。与空白对照组相比，
阴性对照组表皮活细胞层变薄，真皮层成纤维细胞
密度减少，且空泡增多，说明UVR刺激条件有效。
与阴性对照组相比，给药组表皮活细胞层明显增厚，
真皮层成纤维细胞密度增加，说明重组胶原蛋白在
0.05%、0.2%时可使组织形态发生明显改善。
组的胶原纤维含量显著上升，而且给药浓度越高，
胶原纤维相对面积值越高（P＜0.01），说明重组
胶原蛋白在0.05%、0.2%时对紫外损伤后的胶原纤
维重建有明显的改善，而且0.2%以内浓度越高，效
果越好。
表6 胶原纤维相对面积汇总表
试验分组相对面积平均值SD P-value
空白对照 1.000.05/
阴性对照0.570.010.000##重组胶原蛋白0.05%0.650.020.001**
重组胶原蛋白0.2%0.780.010.000**备注：用t-test方法进行统计分析时，NC组与BC组相比，显著性以#表示，P-value<0.05表示为#，P-value<0.01表示为##；样品组与NC组相比，显著性以*表示，P-value<0.05表示为*，P-value<0.01表示为**。
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4.Collagen IV 测试结果。培养结束后对皮肤组织进行Collagen IV 蛋白含量测试，具体结果汇总见表9、
表10。与空白对照组相比，阴性对照组的Collagen IV 蛋白含量显著下降，说明本次测试刺激条件有效。与阴性对照组相比，样品重组胶原蛋白
3.弹性纤维测试结果。培养结束后对皮肤组织进行弹性纤维测试，具体结果汇总见表7、表8。与空白对照组相比，阴性对照组的弹性纤维含量显著下降，说明本次测试刺激条件有效。与阴性对照组相比，样品重组胶原蛋白0.05%、重组胶原蛋白0.2%
表7 皮肤组织弹性纤维含量的变化情况
表9 皮肤组织CollagenIV 蛋白含量的变化情况
表8 弹性纤维相对面积汇总表
试验分组相对面积平均值
SD P-value
空白对照 1.000.10/阴性对照0.650.080.009#重组胶原蛋白0.05% 1.180.050.001**重组胶原蛋白0.2%
1.29
0.04
0.000**
备注：用t-test 方法进行统计分析时，NC 组与BC 组相比，显著性以#表示，P-value<0.05表示为#，P-value<0.01表示为##；样品组与NC 组相比，显著性以*表示，P-value<0.05表示为*，P-value<0.01表示为**。
的弹性纤维含量显著上升。给药浓度越高，弹性纤维相对面积值越高（P ＜0.01），说明重组胶原蛋白在0.05%、0.2%时对紫外损伤后的弹性纤维的重建有明显的改善，而且0.2%
以内浓度越高，效果越好。
0.05%、重组胶原蛋白0.2%的Collagen IV 蛋白含量显著上升，而且给药浓度越高，Collagen IV 蛋白含量值越高（P ＜0.01），说明重组胶原蛋白在0.05%、0.2%时对紫外损伤后的Collagen IV 蛋白合成有明显的改善，而且0.2%以内浓度越高，效果越好。
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