网络出版时间：2022 - 15 -25 17 ：14 网络出版地址：httys ：//6us. codi. uet/6cms/OetWl/34. 1473. o. 24241229. 1457.207. html
口腔鳞状细胞癌中NFATc2的表达和定位
王元杰3彭宏峰2，董 伟2 *，梁永强2，董 青2，张瑾瑾7，马 冬5 *
接受日期：2529 -59 -25
基金项目：河北省医学科学研究课题(25191599)
作者单位4唐山职业技术学院口腔系，唐山063395
5华北理工大学口腔医学院、7公共卫生学院，唐山
063415
作者简介：王元杰，女，硕士，讲师，主治医师。E-mail ： 571155453@
uu0aom
彭宏峰，男，硕士，讲师，主治医师，通讯作者。E-mail ：
154297211@ qq. com
摘要：目的 分析口腔鳞状细胞癌(oral syuamoas cell camiuomas , OSCC )组织中与受体型蛋白酪氨酸磷酸酶K( receptor proteiu
tymsiue phosphatase-K, PTPRK )相关的胞质活化 T 细胞核因子 c2 蛋白(gcleaf factor of activated T ceUs ch , NFATch)的表达和
定位，探讨PTPRK 抑制OSCC 的潜在机制。方法 生物信息学预测与PTPRK 相互作用的蛋白，免疫组化检测OSCC 组织及相
应癌旁口腔黏膜组织(对照组)中NFAT c 2表达及其与PTPRK 的关系，免疫荧光染检测NFATc2在人正常口腔上皮细胞系
HIOEC 和OSCC 细胞系SCC25中的表达和细胞核定位情况，并分析其蛋白表达与OSCC 临床病理特征的关系。结果 生物信
息学预测结果显示在分子通路方面PTPRK 可能与NFATc2关联；与对照组比较,NFATc2在OSCC 组织中的表达显著升高(P
<0.05)，且与PTPRK 表达呈负相关(P<0.01)；细胞免疫荧光染结果显示，与人正常口腔上皮细胞系HIOEC 比较，OSCC
细胞系SCC25中NFATc2表达水平升高且表达入核;OSCC 中NFATc2表达与临床分期和病理分级相关(P 均<0. 05)。结论
NFATc2表达增加且入核与PTPRK 表达减少相关，并参与OSCC 的发生、进展。
关键词：口腔肿瘤；鳞状细胞癌;NFATc2； PTPRK
中图分类号：R 739. 8 文献标志码：A 文章编号：1001 -7399(2020)12 -1418 -05
doi :44.08315// codi. cjcep. 6022. 15. 207
口腔鳞状细胞癌(on- spuamops call curcinomp ； OSCC )是口腔科最常见的恶性肿瘤，其发病年轻化、
预后差、复发风险高1年生存率仍较低［1"5］，提示
早期诊断十分重要。饮酒、嚼槟榔和吸烟是OSCC 发生的主要因素⑷。本课题组前期研究发现［5］，受
体型蛋白酪氨酸磷酸酶(mepWf pmteix tyrosino phospPatase-K , PTPRK )的表达受DNA 甲基化的影
响并与OSCC 相关，但是其表达下调所影响的下游 分子仍不清楚。OSCC 的发生、发展与炎症相 关®0 ，已有报道炎症可诱导活化T 细胞核因子c2 蛋白(nncleaf factvo of activated T calls c2 , NFATcU )
的表达和入核，进而通过调控炎症相关因子的转录
typec转dp(如ill 和IL-11等)促进胃癌细胞的增殖、迁移和 侵袭［5］；在鼻型自然杀伤细胞1细胞淋巴瘤中,PT-
PRK 表达下调与NFATcU 表达升高相关［9］，以及 NFATcU 通过上调原癌基因ETS1的表达促进乳腺
癌细胞的侵袭J 2］。尽管目前在口腔癌的遗传多态
性［11］和细胞水平上已有转录因子NFATcU 方面的 研究报道［14］，但是NFATcU 与PTPRK 的关系及其临
床意义的研究仍显不足。因此，本实验采用生物信
息学预测.OSCC 临床样本、人正常口腔上皮细胞系 HIAEC 和OSCC 细胞系SCC25进行实验，探讨 NFATcU 在OSCC 中的表达和作用，为OSCC 的早期
诊断和提供实验依据。
1材料与方法
1.4材料
1.0.0 一般资料 选取2018年1月~2015年6月
华北理工大学附属医院口腔科收治的57例OSCC
患者，均经病理诊断明确。其中男性34例，女性23
例，年龄67 ~67岁，中位年龄(54.21 ±5. 37)岁；
TNM 分期：I + I 期19例、皿+ V 期38例。另收
集癌旁正常口腔黏膜组织标本61例作为对照组。
两组标本在采集完成后迅速用生理盐水清洗血渍,
并用4%多聚甲醛固定和石蜡组织包埋以及部分样
本进行液氮冻存。
1.0.2细胞系 人正常口腔上皮细胞系HIOEC 和
人OSCC 细胞系SCC25，购自中国科学院上海细胞
库。采用含10%胎牛血清的DMEM 培养基，并加链
霉素(170 R g/mL )和青霉素(100 U/mL), 5%CO 2 77 °C 培养。
149 方法
1.2.0 生物信息学预测 DNA 采用在线GeneMA-
NIA网站预测与PTPRK关联度高的基因(http：// /seamh/homo-sapiexs/PTPRK)。
1.2.2免疫组化所有标本均经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋1R i厚切片。免疫组化染采用SP 法，染步骤严格按试剂说明书进行。随机选取5个癌巢内的视野，通过Image-Pm Pins6.0软件(美国MEDIA CYBERNETIF图像技术公司)分析棕颗粒在整个视野内所占百分比。
1.2.2细胞免疫荧光染培养人正常口腔上皮细胞系HIOEC和OSCC细胞系SCC25细胞爬片, 4%多聚甲
醛固定9mix,0.5%Triton PBS通透2 mix,14%山羊血清封闭，应用鼠单克隆抗体NFATcU (1:50,sc-6296,Santa Cruz公司)稀释液4C孵育过夜，Flnoresceix标记的抗兔二抗(anti-PTPRK,
1:80稀释，红)室温孵育43mix,DAP)染核，细胞核呈蓝。荧光显微镜下观察人正常口腔上皮细胞系HIOEC和OSCC细胞系SCC25中NFATc2表达的荧光强度和核定位情况，采用Image Pre-Pins 6.0软件定量分析NFATcU的表达水平。结果判定: NFATcU蛋白在OSCC中的表达水平高于配对对照组织中的表达定义为高表达；在OSCC组织中的表达低于配对对照组织的表达定义为低表达。
1.3统计学分析所有数据采用SPSS19.0软件进行统计学处理。计量资料采用p±s表示，两组间数据比较行t检验；计数资料采用例数表示，行x2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
9结果
9.4OSCC组织中NFAT c2的表达采用Genc-MANIA网站在线预测与PTPRK基因表达在分子互作、共表达、共定位和分子通路等方面相关的基因结果显示，/TPRK与NFATc2基因关联度高，主要表现在分子通路关系(图1)；采用免疫组化实验进一步证实了预测结果，在OSCC组织中NFATcU表达显著升高(P<0.01)，且其表达主要定位于细胞核(图2)o
2.2OSCC组织中PTPRK与NFAT c U表达的关系免疫组化检测OSCC组织中PTPRK的表达，其中PTPRK
高表达21例，低表达36例；并将PTPRK 高表达和低表达OSCC组织样本中的NFATc2阳性细胞数进行统计分析，在PTPRK高表达OSCC组织中NFATc2表达减少；相反，/TPRK低表达OSCC组织中NFATc2表达明显升高[(14.8±
3.2)%e (55.9±
4.4)%,P<0.01，图3]o 图1GeneMANIA网站预测与PTPRK基因表达相关的基因：圆圈大小代表关联度大小，红线代表相互作用，蓝线代表分子通路
口腔鳞状细胞癌组
对照组
100
80
60
40
20
~T
(
％
)
玄0
血
屈
ffi
tf E
z
q
l
y
d
x
对照组(n=41)口腔鳞状细胞癌组(n=41)
图2口腔鳞状细胞癌和正常对照组织中NFAT c U的表达:A.免疫组化检测NFATcU的表达,SP法;B.柱状图显示NFATcU的表达；与对照组相比,**P<0.01
2.3NFAT c U在人正常口腔上皮细胞系HIOEC 和OSCC细胞系SCC29中的表达和定位采用免疫荧光染证实NFATc2在人正常口腔上皮细胞系HIFEC和OSCC细胞系SCC25中的表达和定位，结果显示在HIOEC中，NFATc2表达较少且定位于细胞质中，而在SCC25中其表达升高1.89倍(P<
4. 021)，且其表达核定位显著增加，提示在OSCC 中 NFATcU 表达明显升高，且在细胞核中发挥生物学
功能(图4)o
2.3 NFAT c U 表达与OSCC 临床病理特征的关系OSCC 中NFATcU 表达与患者性别、年龄和淋巴结
转移无关(P 均>2. 45)；而与TNM 分期和分化程度 有关(P 均<4. 45，表()o
3讨论
NFAT 家族蛋白最初在活化的T 细胞中作为 IL2的转录激活蛋白而鉴定得到，包含一个高度保
守的 REL 同源区域(REL-homo/gy Oomaiu , RHD ),
与DNA 结合来调控下游基因的转录，其不仅调控T
细胞的发育和分化，而且还促进肿瘤细胞的生长、增 殖、迁移、侵袭和新生血管形成⑴一⑷。目前已有报 道NFATcU 表达能够促进胃癌⑻、肺癌〔⑸、黑素
瘤J 0 ］、食管癌J 0 ］和肉瘤J 5 ］的发生、发展。
本组前期实验发现5 ］ ,PTPRK 基因启动子DNA
高甲基化导致其表达减少在OSCC 中具有重要临床
意义。本实验通过生物信息学预测和OSCC 临床样
本及细胞系实验验证发现,PTPRK 与NFATc2表达
在分子通路上具有相反的关系，此结果与在胃癌和 淋巴瘤中的研究结果一致。STAT3信号异常激活与 OSCC 的发生、发展密切相关［2 ］。Qi 等〔5 ］在表观遗
PTPRK 高表达口腔鳞状细胞癌
PTPRK NFATc2
PTPRK 低表达口腔鳞状细胞癌PTPRK NFATc2
「工
工
80 B
20
(％)弐0皿«*
凰
愿曲E
6040
_ 口 咼表达PTPRK(«=21)
0 低夷达P TPRK(w=36)
PTPRK NFATc2
图6 口腔鳞状细胞癌组织中PTPRK 与NFAT c U 的表达:A.免疫组化检测，SP 法;B.柱状图显示PTPRK 与NFATc2的表达；与PTPRK 高表
达组相比1* P<0. 01
NFATc2 DAPI
U W O I H
s e o o s
Merge
5
5
0 5 0
2 2 L l.a 蜃
13
来
謎
衩眉
HIOEC SCC25
图4人正常口腔上皮细胞系HIOEC 和口腔鳞状细胞癌细胞系SCC25中NFAT c U 的细胞免疫荧光染结果:A.红代表NFATc2染结
果，蓝代表DAPI 细胞核染结果；B.柱状图显示各细胞系中NFATc2的表达；与HIOEC 相比，*** P <0.
001
表1口腔鳞状细胞癌中NFATcC表达与临床病理特征的关系临床病理
参数a
NFATch
x9值P值低表达高表达
性别
男391321
0.C570.545女2372
年龄(岁)
<52211011
2.9720.13
252361026
TNM分期
I+I2118
6.5090.011皿+V38929
分化程度
高3122
5.0780.023
中+低26521
淋巴结转移
无29132
2.4590.12有28721
传学变化促进胃癌进展的机制研究中发现，STAT3信号通过组蛋白H3的丝氨酸磷酸化异常激活丝裂原和应激激活蛋白2(mitogen-and stress-act/ated pmtein Uinass2,MSK2)表达，共同形成正反馈环复合物并结合于NFATch启动子上激活其转录表达，进而NFATch蛋白表达入核并转录上调炎症相关因子，即STAT3/MSK2/NFATc2信号轴在促进炎症和胃癌的发生、发展中发挥重要作用。与此同时, Chen等⑼在鼻型自然杀伤细胞/T细胞淋巴瘤的研究中发现,PTPRK的DNA甲基化抑制其表达，解除了对STAT3的去磷酸化修饰和信号激活的抑制。因此推测，DNA甲基化介导的PTPRK-5TAT3-NFATch信号轴在OSCC发展进程中具有重要作用，有望成为靶点。
通常状态下,NFATch以高度磷酸化修饰存在于胞质中，当细胞受到异常刺激作用时,NFATc2作为钙调磷酸酶的底物去磷酸化，随后入核发挥其转录调控炎症相关因子的作用［0］。尽管本实验并没有检测其磷酸化修饰状态，但是其磷酸化修饰后的入核现象在OSCC组织和SCC25细胞系中均已被证实，表明其主要在细胞核中发挥炎症调节的功能并促进肿瘤的发生。另外，该研究结果提示，NFATc2去磷酸化修饰的钙调磷酸酶抑制剂的应用，如他克莫司(tacmlimus,FK506)或环抱素A(cyc/spoane A)是否在OSCC中具
有抑制肿瘤的作用将是本课题组今后的研究方向。最后，本实验从临床角度证实了PTPRK下游NFAT c2的表达上调和入核增加与OSCC病理分期和分化程度相关，提示该基因在OSCC的诊断和方面具有重要意义，其相关分子机制研究是课题组下一步的工作重点。
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Fujian Meeical University,Fuzhoo350001,China)
ABSTRACT Purpose To匚/^/玄/the c/nicoxatUoloxicoi fea/ms,immu/ohismchemicgl phedo/pcs,and molecy/r feat Rims of sa/vag seemtog carcinoma(SSC):Methods Nine cases of SSC were ccllecteh for HE s/inRg,immu/ohismchemt istg and special s/ining,and ETV6and NTRK3genes were U c-tec/d bp FISH methoU.Reselts There were6males and3females:ageh from26to74years olU(mehian=36).^3/10x1-cally,the tumors sUoweh microcystic,tuPu/f and solid s W uc-hires■There was secretion within micmcystic and tuPu/f spaces.The/mor cells had mu/d,oval nuclei,each with finely
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Expression and localization of NFATc2ic orpi squamous cell carcinoma WANG YuanPic1,PENG HongAeng9,DONG Wei7,LIANG Yong-Piang7,DONG Qing7,ZHANG JR-jin3,MA Dong3 (1Depatemenr qf Stomatology,Tangspan Vocatioeae oh O Technical Colleee,TangsPan003300,China；
2Schooi l Stomatolofy,，Scaool l PuUlta health,North China Universith l Science ana Tecanolofy,063213,China)
ABSTRACT Purposs To invesWate the expression and I o-canzation of nucleof factor of activa/P T cells c2(NFATc2)os-sociateP with indibition of receptor proWin/msine phosphamset K((TPRK)in oral squamous cell carcinoma(OSCC),and to explore the underlying mechanism of PTPRK inhibiting OSCC. Methods BRinformatics prehicts proteins interachng with PT PRK,immu/ohisWchemical s/ining was useh to ana/ze the ept pression S NFATc2and PTPRK in OSCC Umucs and corresponding adjacent oral cavity mucosa tissue(Control),and Rt mu/oXuorescedcc s/ining was performeh to deWot expression and nuc/or dcanzatRn of NFATc2in HIOEC(human normal o-rat epi/eOum)and SCC25(OSCC)cell lRc.The g/tWnWid between i/cgaseh NFATc2and clinicoxamoloxicoi data was anot /
zeh.RessUs BRinformatics results indicateh that NFATc2map be associateh with PTPRK in terms of molecy/r pathways, Compareh with control,NFATc2expression was significant/int cmaseh in OSCC tissues(P<0.45),and negatived corredwh with PTPRK expmssRn.Cellular immu/oXuomscedce s/ining sUoweh thoR compareh with the human normal oral epitUeliol cell line HIAEC and SCC25cell line；the i/cmaseh expression of NFATch was localizeh in the/uclens.Last,NFATc2expression was re/wh to the OSCC clinical s/ge and hatUolovicoi grade(both P<0.05).Conclusion The i/cmaseh expression of NFATch and its nuclear localization arc associateh with PT PRK indidiCon in the occyrmnce and pgvmssRn of OSCC.
Key worps:oral neop/sms:squamous cell carcinoma, NFATch；PTPRK
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