人乳头瘤病毒6,11型核酸检测标准操作规程（PCR－荧光探针法）
1.目的：规范人乳头瘤病毒(HPV)6,11型核酸检测操作流程，保证检测结果的准确性。
2.应用范围：PCR实验室。
3.职责：
3.1 文件编写：实验室技术员。
3.2 文件审核：实验室主管。
3.3 文件审批：实验室主任。
3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。
4. 参考文献：
4.1《中山大学达安基因股份有限公司人乳头瘤病毒（6,11型）核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光法）说明书》
4.2《中山大学达安基因股份有限公司DA7600核酸序列检测系统用户手册》
5. 内容：
5.1 检测方法：PCR-荧光探针法。
5.2 实验原理：采用一对特异性引物和一条特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过PCR体外扩增法，即高温变性、低温退火、适温延伸进行DNA扩增，并对PCR全过程进行实时监测，从而定量检测人乳头瘤病毒（HPV）6,11型DNA。
5.3 性能参数：
5.3.1 检测下限： 5.0×102基因拷贝/ml。
5.3.2 线性范围：5.0×102～5.0×108基因拷贝/ml。
5.4 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集。
5.4.1 标本类型：泌尿生殖道分泌物棉拭子、生殖道刮片、组织活检标本等。
5.4.1.1 男性尿道分泌物：用细小棉拭子伸入尿道约2～4厘米，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置于无菌试管中，密封送检（采集分泌物前2小时禁小便）。
5.4.1.2 女性生殖道分泌物：用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再用宫颈刷或无菌棉拭子插入宫颈内，停5秒后旋动宫颈刷或棉拭子采集宫颈分泌物，将宫颈刷或棉拭子置于无菌试管中，密封送检。
5.4.1.3 女性尿道分泌物：用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，再用无菌棉拭子插入尿道约2厘米，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置于无菌试管中，密封送检。5.4.1.4 生殖道刮片：用刮片刮取宫颈病灶处脱落细胞，置于无菌玻璃管中，密封送检。
5.4.1.5 组织活检标本（包括宫颈组织、外阴组织、尖锐湿疣疣状组织等）：取可疑组织适量置于无菌玻璃管中，密封送检。
5.4.2 标本保存：标本采集后保存于2～8℃。
5.4.3 运送条件：标本运送采用冰壶。
5.5  设备和试剂：
核酸检测结果阳性参考值阴性
5.5.1 设备： DA7600荧光定量PCR仪、低速水平离心机、生物安全柜、台式高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/干式恒温器、冰箱（4℃、-20℃）、移动/固定紫外灯、冷冻离心机。
5.5.2 试剂：
5.5.2.1 试剂品牌：中山大学达安基因股份有限公司结结核分支杆菌核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒
5.5.2.2 试剂批准文号：国药准字 S2*******。
5.5.2.3 试剂组成：DNA 提取液（500μL/管）2 管；（HPV） 6,11-PCR 反应管（未贴标签）20 人份；（HPV ）6,11阳性质控品（50μL/管）1 管；阴性质控品（500μL/管）1 管。
5.5.2.4 试剂包装规格：单管单人份，20人份/盒。
5.5.2.5 试剂保存和有效期：保存于-20℃；有效期6个月。
5.6 操作过程：
5.6.1 标本的处理：
5.6.1.1 打开恒温水浴槽或加热器，设定温度 100℃。
5.6.1.2 从试剂盒中取出DNA提取液，让其在室温下完全融化。
5.6.1.3 泌尿生殖道分泌物棉拭子的处理：
5.6.1.3.1 向无菌试管中加入1ml灭菌生理盐水，充分振荡混匀，挤干棉拭子。
5.6.1.3.2 吸取全部液体转至1.5ml 离心管中，12,000rpm离心5min。
5.6.1.3.3  去上清，沉淀中加入50ul DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1min。
5.6.1.3.4  12,000rpm离心5min，待用。
5.6.1.4 生殖道刮片的处理：
5.6.1.4.1 向无菌试管中加入1ml灭菌生理盐水，充分振荡混匀。
5.6.1.4.2 吸取全部液体转至1.5ml EP管中，12,000rpm离心5min。5.6.1.4.3 其余步骤同泌尿生殖道分泌物棉拭子处理的3、4步骤。
5.6.1.5 组织活检标本的处理：
5.6.1.5.1 用适量灭菌生理盐水清洗送检组织沾带的血液。
5.6.1.5.2 取约50毫克组织置于干净器皿中，加1ml灭菌生理盐水用匀浆器研磨成组织匀浆，转移至1.5ml 离心管中，12,000rpm离心5min。
5.6.1.5.3 去上清，沉淀中加入50ul DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1min。
5.6.1.5.4 12,000rpm离心5min，备用。
5.6.2 排版：在DA7600荧光定量扩增仪的上机面板表里设置面板。
5.6.3 加样：从-20℃冰箱取出HPV 6,11-PCR 反应管若干管转移至加样区，根据上机面板的位置放好后，直接加入处理好的样本DNA 5μL，2,500rpm 离心1 min。
5.6.4 DA7600荧光定量扩增仪的设置及结果分析：参见《PCR实验室基因扩增检测及结果分析操作规程》。

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