EB病毒（EBV）核酸检测标准操作规程
（荧光PCR法）
1.目的
规范EB病毒核酸DNA（荧光PCR法）检测操作流程，准确进行EB病毒DNA分析。
2.应用范围
使用中山大学达安基因股份有限公司EB病毒核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒（荧光PCR法）和Mx3000P荧光定量PCR仪、Roche480荧光定量PCR仪进行EB病毒DNA检测。
3.职责
由PCR实验室制定程序文件，专业技术人员负责执行，实验室主管负责监督实施。
4.内容
4.1 实验原理及其临床应用
    本试剂盒用一对EB病毒（EBV）特异性引物和一条EB病毒（EBV）特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶(Taq酶)、核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法检测EB病毒（EBV）DNA。用于人血中EB病毒DNA的测定，为临床提供参考，
4.2 标本采集
4.2.1 使用标本类型：全血。核酸检测结果阳性参考值阴性
4.2.2 标本采集；由合作单位按照以下要求进行采集。
4.2.2.1全血：用一次性无菌注射器抽取受检者静脉血2毫升，注入EDTA(乙二胺四乙酸二钠)或枸橼酸钠抗凝剂的玻璃管，立即轻轻颠倒玻璃管混合5-10次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，密闭送检。
4.2.3 标本保存和运送：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待测，保存期为6个月。标本运送采用0℃冰壶。
4.3 试剂准备
4.3.1 供应商：中山大学达安基因股份有限公司。
4.3.2 此实验试剂应放在冰箱-20℃保存，在实验前5分钟取出备用，实验后应立即放回冰箱-20℃。
4.3.3 如果试剂出现了封口蜡破损导致液体外漏以及过期试剂，应及时更换。
4.4 质控品
4.4.1 质控品来源：随试剂盒，由厂家提供。
4.4.2 质控品保存条件：置于-20℃冰箱中保存。
4.4.3 质控频度：每次实验均需做质控。
4.5 操作过程说明
4.5.1 DNA提取
4.5.1.1 质控品处理：取出阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品。8000rpm离心数秒，
吸50ul至0.5ml灭菌离心管中，加入50ulDNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟；12000 rpm离心5分钟，备用。
4.5.1.2 样本处理
4.5.1.2.1 取全血500ul至干燥玻璃试管中，加入生理盐水500ul轻摇混匀；
4.5.1.2.2 取干燥玻璃试管加入1ml淋巴细胞分离液；
4.5.1.2.3 将稀释好的全血用移液器缓慢加入加有淋巴细胞分离液的试管中(注意沿着管壁，速度要慢)；
4.5.1.2.4 2000rpm离心20分钟（建议用水平离心机）；
4.5.1.2.5 吸取白细胞层(从上往下第二层)，加入1.5ml离心管，12000rpm离心5分钟；
4.5.1.2.6 去上清，沉淀中加入50ulDNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1分钟；  12000rpm离心5分钟，上清备用。
4.5.2.1 加样：取PCR反应管若干，加入处理后的样品（标本、阴性质控品、临界或强阳性质控品）上清液5ul,8000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。
4.5.3 PCR扩增
      将准备好的PCR反应管放置于PCR仪上，编辑样本信息并按下列循环参数进行扩增反应：37℃-2min；94℃-2min；（94℃-15ses；55℃-45ses）×40 cyclics；
      EBV检测荧光素：FAM;  反应体系：50ul； 荧光信号收集：55℃-45ses，末端收集。
4.5.3  Mx3000P荧光定量PCR仪的设置及结果分析
4.5.3.1 打开计算机电源。
4.5.3.2 将Mx3000P电源开关打开，在大约1分钟的时间内，仪器将会自检并且能听到滤镜轮转动的声音。打开电脑上的Mx3000P软件，确定软件界面右下面的联机标志呈现绿。如果不是绿而是红，软件会提示，这时只需要继续稍等片刻，待仪器自检完成，会自动连接计算机。
4.5.3.3 在软件的弹出框中选择您要进行的实验类型，通常选择第一项“Quantitive PCR（Multiple Standards）”进行绝对定量分析。
4.5.3.4 确定卤钨灯已经打开。(绿)则说明卤钨灯已经打开；（黄）则说明卤钨灯正在预热；（红）则说明卤钨灯没有被打开，这时需要用鼠标点击这个标志将光源打开。在卤钨灯已经被打开的情况下，软件界面右下方会显示（绿）。
4.5.3.5 最好在仪器与光源预热20分钟后开始实验。
4.5.3.6 在里，对所选孔进行设定，在Well type中设定Standard（标准 品）、NTC（阴性对照）、unkown（样品）等，并选择正确的荧光通道（FAM, HEX, ROX，Cy5），参比荧光（Reference dye）选None。对于标准品，在Well type中设定为“Standard”后，再设定其模板浓度。方法为：点击 ，10倍的浓度梯度可以直接点击，在下拉菜单中选择不同的系数关系
后，依次点击设定为标准品的另外几个孔，浓度将实时显示。也可以直接点击标准品的各个孔位， 在一栏，手工输入浓度。若要对不同的样品进行编号，则双击所选孔，在name框中输入样品号，点击就能显示样品编号。或者点击版面右上方的，导入以前使用的96孔板设定。
4.5.3.7 点击，进行PCR循环的设定，可以直接点击温度、时间改变各项温度、时间、循环数等。在选定大步骤之后添加步骤可选定该大步骤后，点击，或点击鼠标右键，在弹出的对话框中，选择Add Segment，则可在该大步骤之后添加一个大步骤；若是在选定大步骤里面的小步骤后边添加一小步骤，选中该小步骤，点击鼠标右键，在弹出的对话框中选择“Add Plateau with Ramp”。
要删除某个大步骤，直接选定大步骤，点击界面右边的“”，或者点击鼠标右键选Delete，即可删除该步骤。如果要删除一个大步骤里的小步骤，可先选定此步骤时间和温度中间的横线，将其变红，如图，点击界面右边的“”，或者点击鼠标右键选Delete，即可删除该步骤。点击，导入以前设定的PCR程序。
（END）代表在这一步结束时采集荧光信号；（ALL）代表在这一步的全过程都采集荧光信
号，一般用作熔解曲线分析。可直接用鼠标将此图标拖到要采集信号的地方。若要去除，可将其拖出循环设定区域。
4.5.3.8 结束之后，点击软件界面右上方的。会弹出对话框提示：仪器灯源正在预热，需要“马上运行”或者是“灯预热完成后再运行”？通常可直接点击“马上运行”，但最好点击“灯预热完成后再运行”，可以保护灯源。
软件界面右下方会出现运行状态显示框Run Status，点击Start开始实验。在运行过程中可以通过点击Add Cycles来增加扩增的循环数。还可以选择勾选“Turn lamp off at end of run”，在PCR运行结束之后软件将自动关闭卤钨灯。
4.5.3.9 在PCR运行的过程中可以点击，观察样品的实时扩增原始结果。
4.5.3.10  PCR运行结束后，点击，再点击Results，软件将自动进行结果分析，也可点击手动进行结果分析。可以手动调节阈值线（拖动）进行分析。点击可显示标准曲线，看斜率、截距、线性相关是否在可控范围内。左下角的可选择相应的荧光观察扩增曲线。右边的可根据自己的需要选择显示的界面。是扩增曲线，Ct值列表，标准曲线，样本起始浓度，结果excel表格输出，合并面板，包括设置、程序设定、样本Ct值、扩增曲线四个面板。
4.5.3.11 分析曲线时，如果曲线不够光滑，还能用中的Smoothing对曲线进行调节，一般Amplification average是3，可按需要将其调至较大数值，如5、7、9，调整后曲线将更光滑，不过Ct值会稍微靠后一点，使数据失真，通常情况下，不建议这么做。
4.5.3.12 如果需要对每条曲线进行单独的基线设置，点击中的Baseline Correction，点击Adaptive baseline，在下面对应的各孔，单独进行基线起始和终止位置的调节。
4.5.3.13 关于Mx3000P调用前一次实验标准曲线的补充说明。点击桌面Mx3000P的软件图标，弹出话框：选择Multiple Experiment Analysis （多项实验结果分析）选项，点击“OK”，出现如下对话框，建议选择“Use common threshold”进行分析进算，然后点击，导入需要一起分析的上机文件，点击“Finish”即可。
4.5.3.14 这里选择时要注意：1.两个或者多个实验结果要有相同的实验程序 ；2.每次程序中的循环数应该一致。在分析栏可以选择不同实验的不同反应孔进行同步分析。
4.5.3.15 分析质控结果：
阴性质控品：EBV(FAM)Ct值= 40或“No Ct”。
阳性质控品：EBV（FAM）Ct值<33，且有较好的对数增长曲线。
以上要求需在同一次实验中同时满足，否则本次实验无效，需重新检测。
4.5.3.16 记录实验数据。
4.5.3.17 取出结束后扩增仪内扩增产物需用一次性手套包好、封口后，丢入医疗废物垃圾桶内，以防止扩增管破裂而导致污染。
4.5.4 Roche480荧光定量PCR仪的设置及结果分析
4.5.4.1 先打开电脑，再打开荧光定量PCR仪器，然后双击图标“”，打开仪器数据库。
4.5.4.2 双击图标“”，启动罗氏480软件。
4.5.4.3 在弹出的对话框中，输入用户名和密码，进入软件设置界面。
4.5.4.4 在弹出的界面中，点击“”，进入新的实验设置界面：
。
4.5.4.5 在“”菜单栏里，“”子菜单下。
4.5.4.6 将“Detection Format”选择为Daul或3 color的探针杂交类型。
4.5.4.7 将“Reaction Volume”设置为“50ul”。
4.5.4.8 在“Programs”下：通过“”“”来增加总的循环阶段及阶段的循环数，并在“变性→延伸→退火”循环阶段的“Analysis Mode”下选择Quantification。

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