结核分支杆菌（TB）核酸检测标准操作规程
1.目的：规范结核分支杆菌（TB）核酸检测操作流程，保证检测结果的准确性。
2.应用范围：PCR实验室。
3.职责：
3.1 文件编写：PCR实验室技术员。
3.2 文件审核：PCR实验室负责人。
3.3 文件审批：实验室主任。
3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。
4. 参考文献：
4.1《中山大学达安基因股份有限公司结核分支杆菌核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒说明书》
4.2《中山大学达安基因股份有限公司DA7600核酸序列检测系统用户手册》
5. 内容：
5.1 检测方法：PCR-荧光探针法。
5.2 实验原理：
用一对结核分支杆菌(TB)特异性引物和一条结核分支杆菌(TB)特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过PCR体外扩增法，即高温变性、低温退火、适温延伸进行DNA扩增，并对PCR全过程进行实时监测，从而检测结核分支杆菌核酸。主要用于TB感染的辅助诊断及其疗效监测的标准。
5.3 性能参数：
5.3.1 检测下限：5.0×102基因拷贝/ml。
5.3.2 线性范围：5.0×102～5.0×108基因拷贝/ml。
5.4 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集。
5.4.1 标本类型：痰液、肺及支气管灌洗液、尿液等。
5.4.1.1  痰液：清晨从肺深部咳出痰液，取1～3 ml置于无菌玻璃管内，密封送检；婴幼儿用密闭容器与无菌吸痰器相连，吸取痰液，密封送检。
5.4.1.2  肺及支气管灌洗液：收集灌洗液1～3 ml置于无菌玻璃管内，密封送检；
5.4.1.3  尿液：用无菌5ml玻璃管收集中段尿1～3ml，密封送检。
5.4.2 标本保存：标本采集后保存于2～8℃。
5.4.3 运送条件：标本运送采用冰壶。
5.5  设备和试剂：
5.5.1 设备： DA7600荧光定量PCR仪、低速水平离心机、生物安全柜、台式高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/干式恒温器、冰箱（4℃、-20℃）、移动/固定紫外灯、冷冻离心机。
5.5.2 试剂：
5.5.2.1 试剂品牌：《中山大学达安基因股份有限公司结结核分支杆菌核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒》
5.5.2.2 试剂批准文号：国食药监械（准）字2011第3400392号
5.5.2.3 试剂组成：DNA 提取液（500μL/管）2 管；TB-PCR 反应管（未贴标签管）20 人份；TB 临界阳性质控品（50μL/管）1 管；TB 强阳性质控品（50μL/管）1 管；阴性质控品（250μL/管）1 管。
5.5.2.4 试剂包装规格：单管单人份，20人份/盒。
5.5.2.5 试剂保存和有效期：保存于-20℃；有效期6个月。
5.6 操作过程：
5.6.1 标本与质控品的处理：
5.6.1.1 打开恒温水浴槽或加热器，设定温度 100℃。
5.6.1.2 从试剂盒中取出DNA提取液、阴性质控品和阳性质控品，让其在室温下完全融化。
5.6.1.3  痰液标本的处理：
5.6.1.3.1 于痰液中加入4倍体积的4% NaOH，摇匀，室温放置30分钟待液化；
5.6.1.3.2 用头或吸管混匀后吸取1ml液体至1.5ml离心管中，12,000rpm离心5min；
5.6.1.3.3 去上清，向沉淀中加入灭菌生理盐水1ml，混匀，12,000rpm离心5min；
5.6.1.3.4 去上清，向沉淀中加入50μL DNA提取液，充分混匀，100℃恒温处理10±1min，12,000 rpm离心5min，备用。
5.6.1.4 肺及支气管灌洗液、尿液的处理：
5.6.1.4.1 取灌洗液或尿液1.0ml至1.5ml离心管，12,000rpm离心5min；
5.6.1.4.2 去上清，向沉淀中加入灭菌生理盐水1ml，混匀，12,000rpm离心5min；
5.6.1.4.3 去上清，向沉淀中加入50μL DNA提取液，充分混匀，100℃恒温处理10±1min，12,
000 rpm离心5min，备用。
5.6.2 排版：在DA7600荧光定量扩增仪的上机面板表里设置面板。
5.6.3 加样：从-20℃冰箱取出TB-PCR 反应管若干管转移至加样区，根据上机面板的位置放好后，直接加入处理好的样本DNA和阴性质控、阳性质控品各5μL，2,500rpm 离心1 min。
5.6.4 DA7600荧光定量扩增仪的设置及结果分析：参见《达安核酸检测结果阳性参考值阴性7600荧光定量PCR仪操作、校准及保养规程》及《基因扩增检测及结果分析规程》。
5.6.5 记录实验数据。
5.6.6取出结束后扩增仪内扩增产物需用一次性手套包好、封口后，丢入医疗废物垃圾桶内，以防止扩增管破裂而导致污染。
5.6.7 关闭扩增仪电源和计算机电源。
5.7 参考值范围：痰液＜2.5×103基因拷贝/ml,灌洗液/尿液＜5.0×102基因拷贝/ml
5.8 临床意义：直接反映人体内结核分支杆菌是否存在及其复制活跃程度，可作结核分支杆菌（TB）感染的辅助诊断及其疗效监测的标准。
5.9 安全防护措施:
5.9.1 试剂处理:
5.9.1.1 使用或更换试剂时，务必戴手套；不要用身体直接接触试剂，以免损伤皮肤。
5.9.1.2 如果皮肤接触了试剂，立即用大量清水冲洗并消毒。
5.9.1.3 如果眼睛接触了试剂，立即用喷淋器冲洗，并紧急就医。
5.9.2 仪器使用:
5.9.2.1 仪器运转中不要触摸加样机构、试剂分注机构、搅拌机构、反应容器清洗机构等可动部分。
5.9.2.2 仪器通电时不能打开仪器上面、背面、侧面的盖板，不能触摸光源灯的玻璃面。
5.9.3 生物安全防护：参见《生物安全防护手册》
5.10 注意事项:
5.10.1 PCR荧光定量检测法比较容易受污染，所以实验过程中应避免反复开盖，所用耗材均需高压灭菌。
5.10.2 试剂使用前要完全解冻，但应避免反复冻融。
5.10.3 试剂盒DNA提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头的现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截。
6.相关记录表格:
6.1 LAB-SOP-PCR-005-T01-001《PCR实验室实验、交接班记录表》
6.2 LAB-SOP-PCR-015-T01-001《PCR实验室迟发报告登记表》
6.3 LAB-SOP-PCR-014-T01-001《PCR实验室不合格标本登记表》
6.4 LAB-SOP-PCR-025-T01-001《PCR实验室DA－7600取试剂、加样、扩增对照图面版表》
本SOP文件颁发部门: 质管部
本SOP文件分发部门：PCR实验室
本SOP文件编写人:                                      编写日期：    年    月    日
本SOP文件审核人：                                  审核日期：    年    月    日
本SOP文件审批人:                                      执行日期：    年    月    日

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