综  述
ＰＣＲ技术在新冠病毒核酸检测中的应用
张礼 ，邹秉杰综述，宋沁馨，周国华综述
  ［摘要］　自２０１９年１２月底以来，由新型冠状病毒（ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２）感染引起的新冠肺炎（ＣＯＶＩＤ １９）疫情在全世界范围内暴发。新冠病毒具有较强的传染性，因此快速、准确地检测新冠病毒是阻断疾病传播、防控新冠疫情的关键。目前国内外已经出现了多种新冠病毒核酸检测方法，其中聚合酶链式反应（ＰＣＲ）是主流的方法。文章总结了新冠病毒核酸检测中以ＰＣＲ为基础的方法，包括实时定量ＰＣＲ、微滴式数字ＰＣＲ、核酸即时检测技术、多重ＰＣＲ，分析了这些方法的优缺点，并探讨了临床应用的实例。
  ［关键词］　ＰＣＲ技术；新型冠状病毒；核酸检测
  ［中图分类号］　Ｒ５１１  ［文献标志码］　Ａ  　［文章编号］　１００８ ８１９９（２０２１）０５ ０５３９ ０６  ［ＤＯＩ］　１０．１６５７１／ｊ．ｃｎｋｉ．１００８ ８１９９．２０２１．０５．０１９
基金项目：江苏省杰出青年基金项目（ＢＫ２０１８０００５）；江苏省基础研
究计划自然科学基金项目（
ＢＫ２０１９１３２２）作者单位：２１０００２南京，南京大学医学院附属金陵医院（东部战区总
医院）临床药学科［张礼 （医学硕士研究生）、邹秉杰、周国华］；２１０００９南京，中国药科大学药学院（宋沁馨）
通信作者：周国华，Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｈｚｈｏｕ＠ｎｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＰＣＲｉｎｎｏｖｅｌｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ＺＨＡＮＧＬｉ ｋｕｎ１，ＺＯＵＢｉｎｇ ｊｉｅ１ｒｅｖｉｅｗｉｎｇ，ＳＯＮＧＱｉｎ ｘｉｎ２，ＺＨＯＵＧｕｏ ｈｕａ１ｃｈｅｃｋｉｎｇ
（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＰｈａｒｍａｃｙ，ＪｉｎｌｉｎｇＨｏｓｐｉｔａｌ，ＮａｎｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｈｏｏｌｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅ／ＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＥａｓｔｅｒｎＴｈｅａｔｅｒＣｏｍｍａｎｄ，ＰＬＡ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１０００２，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ；２．ＳｃｈｏｏｌｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＣｈｉｎａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
，Ｎａｎｊｉｎｇ２１０００９，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ）  ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］　ＳｉｎｃｅｔｈｅｅｎｄｏｆＤｅｃｅｍｂｅｒ２０１９，ｏｕｔｂｒｅａｋｓｏｆＣｏｖｉｄ １９ｃａｕｓｅｄｂｙｎｏｖｅｌｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｈａｖｅｂｅｅｎｏｃｃｕｒｒｉｎｇｗｏｒｌｄｗｉｄｅ．Ｎｏｖｅｌｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｈａｓａｓｔｒｏｎｇｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ，ｓｏｔｈｅｒａｐｉｄａｎｄａｃｃｕｒａｔｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｎｏｖｅｌｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｉｓｔｈｅｋｅｙｔｏｂｌｏｃｋｔｈｅｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｏｆｄｉｓｅａｓｅａｎｄｐｒｅｖｅｎｔａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｔｈｅｎｅｗｃｒｏｗｎｅｐｉｄｅｍｉｃ．Ｍａｎｙｎｏｖｅｌｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓｈａｖｅａｐｐｅａｒｅｄａｔｈｏｍｅａｎｄａｂｒｏａｄ，ａｍｏｎｇｗｈｉｃｈｔｈｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ｉｓｔｈｅｍａｉｎｓｔｒｅａｍｍｅｔｈｏｄ．ＴｈｉｓｐａｐｅｒｓｕｍｍａｒｉｚｅｄｔｈｅＰＣＲ ｂａｓｅｄｍｅｔｈｏｄｓｏｆｎｏｖｅｌｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｒｅａｌ ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ，ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ，ｒｅａｌ ｔｉｍｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄｍｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲ，ａｎａｌｙｚｅｄｔｈｅａｄｖａｎｔａｇｅｓａｎｄｄｉｓａｄｖａｎｔａｇｅｓｏｆｔｈｅｓｅｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄｄｉｓ ｃｕｓｓｅｄｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｅｘａｍｐｌｅｓ．
  ［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ；ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２；ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
０　引  言
  新型冠状病毒（ｓｅｖｅｒｅａｃｕｔｅｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎ ｄｒｏｍｅｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ２，ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２）是一种单链正股ＲＮＡ病毒，属于冠状病毒科，β病毒属（
Ｂｅｔａｃｏｒｏｎａ ｖｉｒｕｓ）［１］
。ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２可以发生人际传播，且传播能力强于２００３年出现的ＳＡＲＳ ＣｏＶ［２］。其主要传
播方式主要为接触传播和飞沫传播
［３－４］
。人体感染
新型冠状病毒后，轻症患者会出现以发热、干咳为主的症状，重症患者多在发病１周后出现呼吸困难和（或）低氧血症，甚至发展为急性呼吸窘迫综合征及
多器官功能衰竭等［５］。由于ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２的强传染
性和致死性，使用快速、准确、便利的诊断方法对其进行检测是发现传染源、阻断疾病传播链进而防控疫情的关键。
常用的病原体检测方法有病原体培养、血清
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抗体检测、核酸检测等，其中病毒培养检测耗时数天，效率过低；血清抗体检测特异性较低［６］。因此临床上最普遍的检测手段是时间更短、特异性更强、灵敏度更高的核酸检测方法。目前已有多种ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２的核酸检测方法，包括聚合酶链式反应（ｐｏｌｙ ｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）、环介导的等温扩增、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系统等［７－１０］。其中ＰＣＲ技术是最早发展起来的核酸扩增技术，通过高温变性、低温退火、引物延伸的多次循环可将靶标扩增上万甚至上亿倍。作为一种相对成熟的核酸扩增技术，ＰＣＲ技术目前已被广泛应用于生命科学的多个领域［１１－１３］。
本综述对目前基于ＰＣＲ原理检测ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２的方法进行了总结和展望。
１　实时荧光定量ＰＣＲ（ｒｅａｌ ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ，ｒｔ ｑＰＣＲ）
  实时荧光定量ＰＣＲ属于第二代ＰＣＲ技术，可以对核酸进行定量检测。该方法利用核酸扩增时产生的扩增曲线来对其初始浓度进行定量计算，目前主要的方法包括荧光染料法和ＴａｑＭａｎ探针法。１．１　ｒｔ ｑＰＣＲ检测ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２的原理　荧光染料法的原理是：在反应体系中加入一种可以与双链核酸非特异性结合的荧光染料，每一轮循环结束时染料就会结合在扩增产生的双链核酸上，并产生荧光。根据荧光信号达到预定荧光阈值时所经过的扩增循环数（Ｃｔ值）就可判断目标核酸分子的有无。
ＴａｑＭａｎ探针法的原理是：在反应体系中加入一种可以与靶标特异性结合的寡核苷酸探针，其两端分别连接荧光基团和淬灭基团，二者共存时由于荧光能量共振转移现象，无荧光产生。在引物延伸的过程中，具有５’ ３’外切酶活性的ＤＮＡ聚合酶会将探针５’端的荧光基团切割下来，从而产生荧光。根据扩增循环数（Ｃｔ值），可判断靶标分子的有无。
ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２的遗传物质是单链ＲＮＡ，其核酸检测过程包括逆转录和ＰＣＲ扩增两个步骤。首先在逆转录酶的作用下，病毒ＲＮＡ被逆转录为ｃＤ ＮＡ，然后ＤＮＡ聚合酶再对ｃＤＮＡ进行扩增。根据样本扩增曲线的Ｃｔ值，即可判断样本中是否含有ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２核酸。我国国家卫建委推荐的标准是：Ｃｔ值＜３７，可报告为阳性；无Ｃｔ值或Ｃｔ≥４０，为阴性；Ｃｔ值在３７～４０，则重复实验。
１．２　ｒｔ ｑＰＣＲ在新冠检测中的应用　ｒｔ ｑＰＣＲ是ＷＨＯ、中国国家卫生健康委员会等单位推荐的新冠肺炎确诊的标准之一。但是，从大规模的检测结果来看，ｒｔ ｑＰＣＲ具有“假阴性”问题，其阳性检出率仅为３０％。“假阴性”的一个重要原因是待测样本中病毒载量低于常规ｒｔ ｑＰＣＲ检测限，因此，提高ｒｔ ｑＰＣＲ的灵敏度非常关键。
选择新的扩增位点，并设计新的引物可以提高ｒｔ ｑＰＣＲ的检出率。目前常见的目标序列包括非结构基因ｏｒｆ１ａ、ｎｓｐ １２（ＲｄＲｐ）、ｎｓｐ １３（Ｈｅｌｉｃａｓｅ）、ｏｒｆ１ｂ等，以及结构基因Ｅｇｅｎｅ、Ｓｇｅｎｅ、Ｎｇｅｎｅ等［１４］。ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２ＰＣＲ的检测靶标通常包含一个非结构基因和一个结构基因，其中结构基因Ｅｇｅｎｅ、Ｓｇｅｎｅ等用来做筛选检测，而非结构基因ｏｒｆ１ａ、ｏｒｆ１ｂ等用来做验证检测［７］。例如，Ｃｏｒｍａｎ等［１５］设计了针对ＲｄＲＰ、Ｅ和Ｎ基因的三重ＰＣＲ检测方法，其结果显示ＲｄＲＰ基因检测的灵敏度最高（３．８ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎ）。但在检测多种临床样本时，该方法的阳性检出率不高（２８．２％）。为了提高检出率，Ｃｈａｎ等［１６］设计了针对ＲｄＲｐ／Ｈｅｌ、Ｓ和Ｎ基因的检测方法，相比于检测ＲｄＲＰ、Ｅｇｅｎｅ和Ｎｇｅｎｅ，该方法的检出率显著提高。但是，ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２在复制过程中易发生变异，这往往会降低ＰＣＲ检测的准确性。为了到ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２高度保守的序列以提高检测准确性，Ｙｉｐ等［１７］分析了ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２基因组，发现ｎｓｐ ２基因符合保守性和病毒特异性要求，并首次以ｎｓｐ ２基因为靶标检测ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２。该方法在保证特异性及与Ｃｈａｎ的方法相同灵敏度的同时，还缩短了检测时间，１ｈ即可出结果。
ｒｔ ｑＰＣＲ可以满足ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２常规筛查的需求，但对于病毒载量较低的样本（如康复期患者），其检出率并不能令人满意。因此临床上还需要灵敏度更高的方法针对这些特定样本进行检测。
２　微滴式数字ＰＣＲ（ｄｒｏｐｌｅｔｄｉｇｉｔａｌＰＣＲ，ｄｄＰＣＲ）
  ｄｄＰＣＲ是Ｋｉｎｚｌｅｒ和Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ于１９９９年提出的一种核酸定量检测技术，属于第三代ＰＣＲ技术［１２］。与第二代相比，ｄｄＰＣＲ在靶标的绝对定量检测方面具有更高的准确性和灵敏度［１８－２０］。目前，ｄｄＰＣＲ已经在肿瘤突变基因检测、病原体检测等领域中发挥重要作用［２１－２３］。
２．１　ｄｄＰＣＲ原理　ｄｄＰＣＲ通常包括样本分散、扩增、定量检测３个过程［１２］。首先将待测样本送入仪器中微滴化处理，其中的靶标被分散到数千乃至
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数万个纳升／皮升级的液滴中，每个液滴含有０或１条模板。若分散不均，某些液滴则包含两条及以上的模板。随后对所有液滴进行ＰＣＲ扩增并检测每个微滴的荧光信号。扩增前含有１条及以上模板的微滴信号为“１”（阳性），不含模板的微滴信号为“０”（阴性）。根据阳性微滴的比例和泊松分布原理可以计算得到样品中初始目标模板的拷贝数［２４］。２．２　ｄｄＰＣＲ相对于传统ｑＰＣＲ的优势
２．２．１　ｄｄＰＣＲ具有高灵敏度　与传统的ｑＰＣＲ不同，ｄｄＰＣＲ是通过对每一条模板“单分子扩增”产生的信号进行分析来实现定量的，因此其灵敏度有了明显提升［２５］。且样本分散时产生的液滴越多，体积越小，ｄｄＰＣＲ的检测限越低，灵敏度越高。２．２．２　ｄｄＰＣＲ对ＰＣＲ抑制剂有更强的抵抗作用　在提取待测核酸的过程中，往往会残留一些原来样本中的组分，如细菌的某些蛋白、多糖等，这类成分对ＰＣＲ有一定抑制作用。相比于传统的ｑＰＣＲ，ｄｄＰＣＲ对这类抑制剂的抵抗作用更强。Ｄｉｎｇｌｅ等［２６］发现ＳＤＳ和肝素对ｄｄＰＣＲ的ＩＣ
５０
高于ｑＰＣＲ，而ＥＤＴＡ对两种方法的抑制作用类似。ｄｄＰＣＲ有更强的抗性可能是因为在样本分散过程中，抑制剂也被分散到各液滴中，成为“单分子”，相比于在完整体系中的反应，其抑制作用被削弱。
２．２．３　ｄｄＰＣＲ不需要标准品或对照品　传统ｑＰＣＲ在进行核酸绝对定量检测时，需要提前制备一系列梯度稀释的标准品来绘制标准曲线。标准品对质量的要求极高，且检测前需要配置梯度稀释标准液，这样就容易引入人为误差［２７］。另外，不同实验室使用的对照品往往不同，从而造成实验参考性、重复性差的问题。但ｄｄＰＣＲ不需要标准品即可进行绝对定量，从而有效避免了上述问题。
２．３　ｄｄＰＣＲ在ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２检测方面的应用　ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２的传播途径主要是飞沫
传播和接触传播，但仍有气溶胶传播的可能性。Ｌｉｕ等［２８］利用ｄｄＰＣＲ对医院等公共区域的空气样本进行新冠核酸检测后发现，在医院，ＩＣＵ内的沉淀样本、方舱医院厕所的空气样本以及方舱医院医务人员区的空气样本检测呈阳性，其他区域几乎检测不到病毒核酸；在其他公共区域，发生过大规模人聚集的区域病毒核酸浓度较高。这提示我们平时应注意对潜在的含病毒气溶胶的热点区域进行彻底消杀、保持医院通风状况良好并避免聚集。
新冠肺炎患者出院后发生的“复阳”现象引起了人们的关注。“复阳”现象的一个重要原因是康复期患者上呼吸道样本的病毒载量过低，常规ＲＴ ＰＣＲ无法检出［２９－３０］。Ｙｕ等［３１］利用ｄｄＰＣＲ对７６位新冠肺炎患者的痰液、鼻拭子、咽拭子等样本进行检测后发现，症状明显期的患者痰液的病毒载量显著高于鼻咽拭子；而对于载量低于ＲＴ ＰＣＲ检测限的康复期样本，ｄｄＰＣＲ仍可测出核酸拷贝数。此外，在ＲＴ ＰＣＲ测定为阴性的１６１例样本中，ｄｄＰＣＲ测出４例为阳性；而ＲＴ ＰＣＲ测定为单基因阳性的６７例样本中，ｄｄＰＣＲ测出４１例为阳性，这表明ｄｄＰＣＲ能纠正ＲＴ ＰＣＲ检测的结果。
目前美国的Ｂｉｏ Ｒａｄ、Ｇｎｏｍｅｇｅｎ公司和法国的Ｓｔｉｌｌａ公司已经开发出了基于ｄｄＰＣＲ原理进行新冠检测的试剂盒，其中方法灵敏度最高的Ｇｎｏｍｅｇｅｎ公司检出限（ＬＯＤ）可达０．１７ｃｏｐｉｅｓ／μＬ。但ｄｄＰＣＲ检测对仪器设备要求较高，操作复杂，检测时间较长，这些问题限制了ｄｄＰＣＲ在临床上的应用。因此，即时、快速、准确的ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２检测方法可
以更好的满足临床的需求。
３　基于ＰＣＲ的现场快速检验技术（ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｃａｒｅｔｅｓｔ，ＰＯＣＴ）
  ＰＯＣＴ，又称床旁检测技术、即时检测技术，是一种在采样现场进行的、利用便携式分析仪器快速得到检测结果的一种检测方式［３２］。在病原体检测方面，相比于传统的检测方式，ＰＯＣＴ具有检测速度快、不受场地限制等优点，因此在应对大规模传染病爆发时，ＰＯＣＴ具有重要应用价值［３３－３４］。目前美国的ＭｅｓａＢｉｏｔｅｃｈ、Ｃｅｐｈｉｅｄ公司，德国的ＱＩＡＧＥＮ公司，国内的圣湘等公司已经开发出了基于ＰＣＲ原理的新冠ＰＯＣＴ设备。其中ＭｅｓａＢｉｏｔｅｃｈ和圣湘公司最快仅需３０ｍｉｎ即可完成检测。
在新冠肺炎检测中，ＰＯＣＴ不仅可以加快检测速度，还可以避免检测人员与患者的接触、减低降低感染风险。目前国内新冠肺炎检测的场所主要是医院和第三方检测机构，检测人员需要直接面对待测人员进行取样。尽管有防护措施，但直面患者取样依然会增加检测人员感染的风险。因此很多机构研发出了供人们在家取样的试剂盒。Ｒａｄｂｅｌ等［３５］在２０２０年５月初研发出一套用于唾液收集与检测的方法，该方法允许患者在家收集唾液样本。收集好样本后，患者需要将样本寄送到已受美国临床实验
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室改进法案修正案（ＣＬＩＡ）认证的实验室中，进行检测。家庭采样可以为患者的采样提供便利，提高的检测效率，还能减少人们去医疗机构的次数，避免发生交叉感染。
ＰＯＣＴ虽然可以提高ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２检测效率，但一次只能检测ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２一种病原体。而临床上还有很多与新冠肺炎症状类似的病原体感染。因此同时检测多种病原体并对ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２做出区分具有重要的临床意义。４　多重ＰＣＲ
  多重ＰＣＲ是在常规ＰＣＲ基础上发展起来的一种可同时检测多种病原体的核酸检测技术。通过在单管中加入多种病原体的特异性引物和荧光探针，多重Ｐ
ＣＲ即可对体系中存在的多种病原体基因组片段同时进行扩增检测。相比于单靶标ＰＣＲ，多重ＰＣＲ提高了待测靶标的通量，在临床和科研中发挥
着巨大作用［３６－３９］。
４．１　多重ＰＣＲ原理　熔解曲线法的原理是：在同一个反应体系中加入多个靶标的引物和相应的荧光
探针。如果体系中存在与某条探针互补的靶标，则扩增后该探针因消耗完毕而不产生熔解曲线。因此通过分析扩增后的熔解曲线可以得知原先存在哪些
目标序列［
３７］
。见图１。４．２　多重ＰＣＲ在ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２检测方面的应用　新冠肺炎疫情发生于２０１９年１２月，这个时段也是其他多种呼吸道病毒感染的高发期，如流感病毒、副流感病毒、腺病毒等，而且新冠肺炎患者的
临床表现与这些呼吸道疾病患者很相似［４０］
。在这
种情况下，临床上非常需要能够快速、准确鉴别多种病原体，并将ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２与其他常见呼吸道病毒区分开的检测方法。但传统的Ｐ
ＣＲ方法一次只能检测一种病原体，限制了临床诊断的速度，因此多重ＰＣＲ近年来一直被用于呼吸道多重病原体联合检测，对感染类疾病监控、分流诊疗有着长远的
指导意义［
４１］
。目前美国的Ｌｕｍｉｎｅｘ公司，法国的ＢｉｏＭéｒｉｅｕｘ，国内的捷诺生物、达安基因等公司已经开发出了基于多重ＰＣＲ原理的新冠检测试剂盒。其中捷诺生物、Ｌｕｍｉｎｅｘ、ＢｉｏＭéｒｉｅｕｘ最多可同时检测２２
种不同的病原体。
  　ａ：将待测模板与多种探针混合，进行ＰＣＲ反应；ｂ：待测模板与相应的探针结合，其余探针不发生结合；ｃ：延伸时Ｔａｑ酶利用５’ ３’外
切酶活性将探针切割，其余未结合探针完好无损；ｄ：反应结束后测剩余探针的熔解曲线，并做导数图，被切割的探针导数图中无峰出现，说明样本中含有其对应的靶标
图１　熔解曲线法原理
Ｆｉｇｕｒｅ１　Ｓｃｈｅｍａｔｉｃｄｉａｇｒａｍｏｆｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐｌｅｏｆｔｈｅｍｅｌｔｅｄｃｕｒｖｅｍｅｔｈｏｄ
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５　结  语
  在新冠疫情检测方法中，基于ＰＣＲ的荧光定量ＰＣＲ、数字ＰＣＲ、多重ＰＣＲ等诊断技术各有优缺点，适用于不同的条件。实时荧光定量ＰＣＲ发展最为成熟，在临床检测中最为常用。在医院、第三
核酸检测结果阳性参考值阴性方检测机构等有生物安全防护条件的场所，荧光定量ＰＣＲ是ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２检测的“主力军”；但其检测效率受假阴性制约，检出率只有３０％～５０％。数字ＰＣＲ可定量检测病毒拷贝数，且灵敏度高于荧光定量ＰＣＲ，对于康复期患者低病毒载量的上呼吸道样本，数字ＰＣＲ仍可检出ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２；但其检测成本高，操作复杂，难以普及。多重ＰＣＲ可实现多重病原体联检，对感染类疾病监控、分流诊疗有着长远的指导意义，但对仪器的要求较高，在基层医疗机构难以推广。ＰＯＣＴ检测速度快，操作简便，可以在家中、车站等无生物安全防护条件的场所进行检测，但目前上市的ＰＯＣＴ检测仪器数量有限，且价格昂贵，难以普及。
目前全世界范围内，新冠肺炎疫情仍未消退，其诊断方法仍是当下研究的重点，未来我们仍需要高灵敏度、高特异性、低成本、易操作、时间短的诊断方法。相信随着研究的不断深入，新型诊断技术会不断满足临床需求，为患者生命健康保驾护航。
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医学研究生学报２０２１年５月第３４卷第５期　ＪＭｅｄＰｏｓｔｇｒａ，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．５，Ｍａｙ，２０２１

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