•新型冠状病毒专题•
恢复期血浆中新型冠状病毒核酸的提取试剂
盒效率比较和检测方法适用性考察
姜晓，周桥胜^董德梅2董科成3孙勇'梁雪1秦婷婷4林涛5谢一舟1丁亚凌1
1成都蓉生药业有限责任公司质量检定部610041; 2北京天坛生物制品股份有限公司血源
管理中心1()()〇24; 3武新单采血浆站有限公司，监利433300; 4成都蓉生药业有限责任公
司科研开发部610041; 5成都蓉生药业有限责任公司血浆检测部610041
通信作者：丁亚凌，Email: d i n g y a l i n g l@sinopharm
【摘要】目的通过比较提取效率选择新型冠状病毒核酸提取试剂盒，并考察方法对血浆的核酸
检测适用性。方法采用3种不同厂家核酸提取试剂盒对血浆中新型冠状病毒核酸进行提取，使用1
种核酸检测试剂盒进行扩增和核酸检测。结果核衣壳蛋白（nude〇capC1d，iV)基因片段和开放阅读框
la/b(open reading frame la/b，ORFlu6)基因片段标准曲线的线性相关系数均>0.999。核酸提取试剂盒
A对O R F ld基因的回收率为91%，对]V基因的回收率为38%；试剂盒B对Oi?F la6基因的回收率为
1〇4%，对iV基因的回收率为44%；试剂盒C对基因的回收率为（)％，对N基因的回收率为
12%。采用试剂盒A、B均能达到100%正确率，试剂盒C仅能达到62. 5%正确率，误检均为假阴性。
结论采用提取试剂盒A、B和新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒进行核酸检测，均能满足新型
冠状病毒肺炎康复者恢复期血浆中病毒核酸的检测需求。
【关键词】新型冠状病毒肺炎；恢复期血浆；核酸提取；定量聚合酶链反应
【中图分类号】R457 DOI： 10. 3760/cma.j311962-20201027-00109
Efficiency comparison of extraction kits and suitability study of detection method for 2019 novel coronavirus
nucleic acid in convalescent plasma
Jiang Xiao1，Zhou Qiaosheng1，Dong Demei2，Do?ig Kecheng3 , Sun Yong', Liang X ue1, Qin
Tingting4 , Lin Tao5, Xie Yizhou1, Ding Yaling1
'Quality Control Department, Chengdu Rongsheng Pharmaceuticals Co.,Ltd., Chengdu 610041,
China; 2 Plasma Management Center，Beijing Tiantan Biological Products Co.，Ltd.，Beijing 100024 ,
C h in a;、Wu Xin Blood Station，Jianli 433300，China; 4Research and Development Department,
Chengdu Rongsheng Pharmaceuticah Co.，Ltd.，Chengdu 610041，China; sPlasma Test Department，
Chengdu Rongsheng Pharmaceuticals Co.，Ltd.，Chengdu 610041，Chi?ia
Corresponding author ••Ding Yaling，Email: *************************
【Abstract】Objective To choose 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) nucleic acid extraction kits
by comparing their extraction efficiency and to investigate the suitability of detection method for nucleic
acid in plasma sample. Methods The 2019-nCoV nucleic acid in plasma was extracted using 3 differen
t
nucleic acid extraction kits. The open reading frame ta/b(ORFlab)and nucelocapcid (N) genes were
amplified and detected using same nucleic acid detection kit. Results The correlation coefficients of
ORF\ab and N gene fragments standard curves were both ^ 0. 999. Extraction kit A had a recovery rate
of 91 %for ORF\ab and 38% for N. Kit B had a recovery rate of 104% for ORF\ab and 44% for N. Kit
C had a recovery rate of 0%for ORF\ab and 12% for N.The accuracies of kits A and B were both
100%, while kit C was 62. 5%attributing to false negative results. Conclusion Except for kit C, both
kits A and B can be used with 2019-nCoV nucleic acid detection kit for virus nucleic acid detection in
COVID-19 convalescent plasma.
【Key words】COVID-l9; Convalescent plasma; Nucleic acid extraction；Quantitative polymerase chain reaction
DOI：10. 3760/cma. j. cn311962-20201027-00109
2019年底暴发的新型冠状病毒肺炎（COVII> 19)疫情已经在全球范围内造成了健康威胁，其病原 体为新型冠状病毒（2019 n o v e l co ro na vi ru s，2()l9-nCoV)[1]。在缺少特效药的情况下，COVICM9康 复者恢复期血浆因含有特异性抗体，可以中和C()VIEH9患者体内病毒，被我国列人重型和危重 型病例的方案，主要适用于病情进展较快及重 症和危重症COVIIM9患者M。
为确保患者安全，COVII>19康复者恢复期血 浆输注前需要进行2()19-nCoV核酸检测，单人份血 液样本检测结果应为阴性[3]，目前2()19-nC〇V核酸 检测主要采用实时荧光定量PCR (r e a l t i m e f l u o r e s c e n c e q u a n t i t a t i v e PC R，RT-PCR)法。
2019-nCoV是p属单股正链R N A病毒，基因 组长29 kb，病毒基因组全长的2/3为开放阅读框 (open r e a d i n g frame，O R F)，3'端基因编码结构蛋 白，包括包膜蛋白（envelope，E)、膜蛋白、核衣壳蛋 白（nu c l e o c a p s i d，N)、刺突蛋白[5]。现有的核酸检 测试剂盒主要针对2019-n C o V基因组保守程度高 的和£基因序列区域进行引物设计。
核酸检测的影响因素很多[5]，已有研究表明，不 同的2(n9-nC〇V核酸检测试剂盒检测性能具有差 异，直接影响检测结果和判定M。而核酸提取作为 核酸检测前的必要步骤，提取效率的高低也将直接 影响到检测结果。因试剂品牌和方法学不同.使用 不同的提取试剂会^响核酸提取效率[7%]。目前 2019-nCoV核
酸提取主要采用手工过柱法、磁珠法 和一步法。相关研究表明，手工过柱法提取的阳性 率最高，其次为磁珠法，一步法漏检率最高[9]。
本研究选择手工过柱法进行核酸提取，比较不 同提取试剂盒用于血浆样品中2019-n CoV核酸的 提取效率，评价核酸提取对检测结果的影响。通过标准曲线的线性和质控品的检测结果评价核酸检测 方法的适用性。
1材料与方法
1.1样本
质控品：2«19-n C o V伪病毒颗粒（来自国家卫 生健康委员会临床检验中心），用健康人血浆稀释至 不同浓度，加防腐剂，分装，-2(1 °C冻存，共8份。样品：采用健康人血浆将核酸检测试剂盒中的阳性 对照进行1〇〇倍稀释，混匀，分装，_ 80 °C冻存。对 照品：用核酸提取洗脱液作为稀释剂，将核酸检测试 剂盒中的阳性对照进行〗()()倍稀释。
1.2试剂盒
核酸提取试剂盒：商品化试剂盒A、B、C；核酸 检测试剂盒：新型冠状病毒2()19-n CoV核酸检测试 剂盒，均购自上海捷诺生物科技有限公司。
1.3检测设备
G N-96S型GNCycler多重病原微生物核酸检 测系统购自上海宏石医疗科技有限公司。
1.4方法
1.4. 1核酸提取方法采用核酸提取试剂盒A、
B、C分别按照各自说明书对样品和质控品进行核酸 提取操作，操作比较见表1。
1.4.2 R T-P C R按照核酸检测试剂盒说明书进 行RT-P C R扩增及结果分析。R T-P C R扩增程序 为：逆转录 50 °C，5 min；预变性 95 °C，20 s;PCR 95 °C，10 s，57 °C，1 min, 45 个循环。
1.5检测方法建立分析
1.5. 1标准曲线建立用核酸提取洗脱液作为稀释剂，将阳性对照做连续5倍稀释后，进行RT-PCR 扩增，以稀释度的对数为横轴，荧光强度达到预设的 阈值时体系的P C R循环阈值（c y c l e o f threshold，Ct)为纵轴，绘制标准曲线。
表1不同核酸提取试剂盒提取步骤比较
蛋白去除•核酸释放柱纯化核酸洗脱
试剂盒-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------设备(条件）
步骤/步耗时/m in 步骤/步耗时/m in 步骤/步耗时/min
A    4 15    4 10 1  5 离心机（12 ()()() X 容）
B    4 25    5 15 1丨(）离心机(20 ()()() X g)、恒温孵育器(56 X：)
C    3 15    5 15    2 15 离心机(9 600X发）、恒温孵育器(56 °C)
实验编y
图2
不同新型冠状病毒核酸提取试剂盒提取效率比较
2. 3准确性
样品信息及检测结果见表3，除5号质控品为
阴性，其余质控品均应为阳性。按照检测结果定性
判定质控品，试剂盒A 和B 均达到100%正确率，C 仅能达到62. 5%正确率，误检均为假阴性。
3
讨论
本研究发现，采用核酸提取试剂盒A 、B 和 2019-n C o V 核酸检测试剂盒进行血浆中2019- nCoV核酸的提取和检测，其标准曲线和提取效率 均较理想，样品检测结果的正确率高。与试剂盒B 相比，试剂盒A 具有无需孵育设备、操作更简便、用 时更短的优点。故推荐用试剂盒A 作为提取试剂
盒，新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒作为 检测试剂盒，用于C〇Vir>19康复者恢复期血浆中 病毒核酸的检测。
不同的核酸提取试剂盒因品牌和方法学不同， 对血浆样品中2019-nCoV核酸的提取效率也有所不
261----------1----------1----------1----------1----------1----------1
-3.0 -2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0
lg 稀释度 ®
lg 稀释度 ®
注：r ：相关系数
图1新型冠状病毒不同基因的核酸检测标准曲线A 核衣壳蛋
白
B
开放阅读框1a/b
1.5.2核酸提取回收率用3种核酸提取试剂盒 对样品进行核酸提取.将对照品与提取后的样品进 行R T -P C R 扩增。根据Ct和标准曲线，分别计算 样品(P )和对照品(R )中的基因片段相对含量，样品 中基因片段回收率/% =卩+ 1^><1〇(>。根据检测试 剂盒说明书，任一基因片段检测为阳性，则判定样品 检测结果为阳性，故取回收率结果较高者作为试剂 盒提取回收率。提取效率为回收率乘以提取的浓缩 倍数。
1.5.3准确性对8份质控品进行核酸提取及 R T-PCR扩增，按照检测试剂盒说明书判定结果，以 Ct作为判定标准，任一片段Ct低于37为阳性，两 个片段Ct均高于或等于37或未检出为阴性。1.6数据分析
试剂盒间差异满足方差齐性，用/检验分析，采 用SPSS 23. U 软件进行数据处理和统计学分析。
2
结果
2. 1标准曲线建立
N 和O F F l d 基因片段的标准曲线如图1所 示。Ct与稀释度的对数成线性关系，各3次实验的 线性相关系数均>(). 999。在一定范围内，核酸检测 试剂盒的检测值(Ct)能准确反映样品中的病毒核酸含量。
2.2核酸提取回收率
3种提取试剂盒的提取效率结果见表2，其中C 的提取效率明显低于A 、B ，且未能提取出样品中的
基因片段。
以A 和B 各6次实验的提取效率作图，如图2 所示。对两种提取试剂盒的提取效率进行？检验,  = U.276,P = 0. 14•两种试剂盒的提取效率差异无统计学意义。
表2 3种核酸提取试剂盒提取样品的实时荧光定量
PCR 检测结果比较
试剂盒
回收率/%
-浓缩倍数提取效率
核衣壳蛋白
开放阅读框la/b
A 3891  3.3  3. 0
B 44104  3.3  3.4C
12
核酸检测结果阳性参考值阴性
4. 0
0. 5
6
4
2
3
3
3
3
表3不同试剂盒对质控品检测判定比较
质控品-
基因片段八拷贝/m l)试剂盒A的Ct试剂盒B的Ct试剂盒C的Ct
N〇判定N〇判定N〇判定N O判定
141 700  5 820阳性31.0732. 83阳性33.7832. 01阳性36. 19 -阳性216 680  2 328阳性32. 0633. 98阳性35. 8933. 08阳性37.59 -阴性383 40011 640阳性30. 1331.59阳性33.3530. 92阳性36.30 -阳性4  3 574499阳性33. %-阳性39.8833. 07阳性40.33 -阴性500阴性--阴性--阴性阴性641 700  5 820阳性30. 4632.72阳性34. 0131.43阳性35.26 -阳性71853259阳性35. 07-阳性-34. 55阳性41.83 -阴性827 800  3 880阳性31.5836.71阳性35. 0031.79阳性34.67 -阳性注：C t：循环阈值；N：核衣壳蛋白；（)：开放阅读框la/b; -：无
同。建立检测方法时，应对核酸提取试剂盒的提取 效率进行确认，以免因核酸提取试剂盒的提取效率 过低导致假阴性，也应考察核酸检测试剂盒的线性，确认检测具有较好的量效关系，保证最终检测结果 的准确。
提取试剂盒A和B对于Q R F1M基因的提取 回收率较高，对于N基因的提取回收率较低，而提 取试剂盒C对于N基因的提取回收率较高，对于 Oi^F l d基因的提取回收率较低。说明不同提取试 剂盒对于同一基因片段的提取回收率不同。相关研 究表明，不同的检测试剂盒对于同一基因片段的检 出灵敏度也不相同M，可据此选择相应的提取试剂 盒和检测试剂盒。例如检测O R F1M灵敏度高的检 测试剂盒与提取O R F1M回收率高的试剂盒A和B 搭配，能更好地提高2019-nCoV核酸检测灵敏度。
目前用于2019-nCoV核酸检测的检测试剂盒 均采用Ct作为定性判定标准。然而不同检测试剂 盒的判定标准并不统一，Ct也会因仪器，试剂以及 人员操作等的不同而产生波动，从而影响结果判定。本研究表明检测试剂盒检测结果与病毒核酸含量的 对数在一定范围内成线性。目前已有获批的2019- nCoV核酸标准物质，可用于建立标准曲线，对检测 结果进行校正，从而统一判定标准，减小检测波动的 影响，使检测结果更准确可靠。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
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issn. 1672-9455. 2020. 19. 00.
(收稿日期:2020-10-27)

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