新型冠状病毒核酸检测试剂盒的性能研究
摘要：对一种国产新型冠状病毒核酸检测试剂盒进行性能研究，评估试剂盒检测能力是否符合厂商声明及满足临床检测需求。参照相关文件，结合阳性质控品、临床样本，对一种国产的新型冠状病毒核酸检测试剂盒进行准确度、精密度、最低检出限方面的性能验证研究。上海伯杰试剂盒在准确度、精密度和最低检出限方面的检出效果都很好。能够满足临床的使用需求，同时也为实验室在新型冠状病毒的诊断和中提供有效的参考。
关键词：新型冠状病毒；核酸检测；性能研究
新型冠状病毒[1]（SARS-CoV-2）是自2019年12月暴发的新型传染病毒，一种有包膜的RNA病毒，属β冠状病毒属。2020年1月初，张永珍教授领导研究团队使用高通量测序技术[2]对病毒基因组进行了测序。于海江等[3]研究发现，SARS-CoV-2与SARS-CoV-1在基因序列上有79%的相似性。新型冠状病毒主要入侵肺泡上皮细胞，在潜伏期患者没有任何临床症状。现有病例资料提示，新冠患者发病时的常见症状为发热、肌肉酸痛、呼吸困难等。少数患者伴有上呼吸道和消化道症状。重型感染的症状包括呼吸困难、低氧血症等。2020年1月20日，SARS-CoV-2被纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，并采取的防控
措施进行管理。在国家卫健委发布的新版本指南中，qRT-PCR[4]核酸检测是SARS-CoV-2诊断“金标准”。该检测方法结果解释快速简便，检测费用低廉，而且有较好的灵敏度、特异性、检测速度较快和操作相对方便等优势，特别适合本次大规模流行的新冠肺炎疫情。目前批准应用的许多SARS-CoV-2核酸检测试剂盒通常缺乏长时间、大样本的临床验证数据，其质量和性能参数不可避免地存在一些缺陷，对检测结果造成影响。因此，验证SARS-CoV-2核酸检测试剂盒的性能，有助于提高检测结果准确性，可以为实验室在新型冠状病毒的诊断和中提供有效的参考。
1  资料与方法
1.1  一般资料
选取2022年6月-2023年1月在吉县人民医院实习期间医院接收的160例标本为研究对象，其中阴性标本80例、阳性标本80例。阳性标本：2022年6月-2023年1月在吉县人民医院确诊的80例新型冠状病毒肺炎患者的临床检测后剩余咽拭子标本。阴性标本：2022年6月-2023年1月在吉县人民医院发热门诊就诊的有干咳、乏力、呼吸困难等症状的疑似新冠肺炎患者的临床检测阴性后剩余咽拭子标本80例。
1.2  研究方法
准确度的验证：使用伯杰核酸检测试剂盒检测80例阴性标本和80例阳性标本ORF1ab和N基因的Ct值，判断阴性和阳性结果，计算阴、阳性符合率和准确率。精密度的验证：将80例阳性标本分别稀释为1*105copies/mL和1*104copies/mL两个浓度，共160例标本，每个标本重复检测20次。记录每次检测ORF1ab和N基因的Ct值，利用Ct值分别计算ORF1ab和N基因变异系数（CV），要求CV值≤5%。最低检出限的验证：选取一份阳性质控品为基础样本，稀释至最低检出限浓度为500copies/mL，进行8次重复检测，记录每组实验结果。最低检出限实验结果与预期结果的符合率为100%即为合格。
1.3  统计学方法
所有资料均以Microsoft Excel 2019，SPSS26.0等统计软件为基础，进行数据处理和统计分析。计算计量资料的平均数、方差、标准差和CV值，计数资料以例数或百分率(%)表示。
2  结果
2.1  实验组160例标本的ORF1ab和N基因的Ct值和阴阳性符合率
实验组160例标本的阳性符合率为98.75%，阴性符合率为100%，准确率为99.375%。
2.2  阳性标本80例稀释为两个浓度测定两基因的Ct值和CV值
80例阳性标本当其浓度为1*105copies/mL时，ORF1ab基因的CV值为0.18%～0.33%，N基因的CV值为0.12%～0.32%。当其浓度为1*104copies/mL时，ORF1ab基因的CV值为0.15%～0.31%，N基因的CV核酸检测结果阳性参考值阴性值为0.16%～0.30%，实验结果变异系数均＜5%。
2.3  阳性质控品稀释至最低检出限浓度的两基因的Ct值和检出率
阳性质控品在浓度为5*102copies/mL进行8次重复检测，检出率为100%。
3  讨论
对准确度验证结果进行分析，其阴阳性符合率和准确度均符合要求，可以满足临床需要。对于出现的一例假阴性结果，通过分析可能是因为待测靶序列的变异或其他原因导致序列发生改变，也可能是标本运送及处理不合理等。为尽可能减少假阴性、假阳性结果的出现，可以安排技术水平高的人员进行新冠病毒检测，同时应改进标本采集的手段及其运输条件等，建议同时采下呼吸道样本进行核酸检测或者增加检测次数。
对精密度验证实验结果进行分析，精密度变异系数均＜5%，表明试剂盒具有较好的精密度，满足临床要求。而且N基因的检测结果较ORF1ab基因更稳定，重复性较好。Yang等人对5种试剂盒的性能验证结果也表明N基因的敏感性高于ORF1ab基因的敏感性。这可能由于冠状病毒ORF1ab基因拷贝数相对低。目前，SARS-CoV-2的临床上的检测结果多为单一靶点阳性，可能是双靶点试剂盒内的N区的扩增灵敏度高于ORF1ab区；一些研究人员还声称，病毒N区转录的RNA数量远远高于ORF1ab基因。一旦病毒RNA拷贝数没有达到试剂盒的检测限时，就会直接导致单靶点阳性。
对最低检出限验证实验结果进行分析，阳性质控品在浓度为5*102copies/mL时测得ORF1ab基因和N基因的Ct值均小于40，通过计算阳性率均为100%，检出率为100%，合格。该病毒检测试剂盒能有效地检测病毒标本中的核酸，其最低检测限水平符合我国对检测试剂最低检测限的相关要求。且该试剂盒的检出限与大部分其他试剂盒的检出限相同，能满足临床检测的基本要求。使用检出限较低的检测试剂在检测病毒低拷贝数的标本时更具优势，有利于避免假阴性的发生，提高新型冠状病毒肺炎患者的早期检出率，有利于快速确定传染源。但本研究仅使用N基因和ORF1ab基因进行最低检出限评估，建议后续进行更全面的靶基因验证。
不同的检测方法都有各自的优势和劣势。单一的检测技术可能在一定程度上有局限性，只有通过合作和相互补充，才能更高地服务于临床需求。同时，检测方法的改进仍然是需要探索的，开发检测技术有助于疫情防控，防止在检测过程中样品暴露所造成的潜在传染危害。相信随着科学技术的飞速发展，更多新型、精准且快速的检测技术也将会随之出现，人类终将战胜SARS-CoV-2疫情。
［参考文献］
[1]Zhu Na,Zhang Dingyu,Wang Wenling,et al.A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China,2019[J].The New England journal of medicine,2020,382(8).
[2]王振飞,武颍彩,贾永峰.分子诊断技术在新型冠状病毒肺炎防控中的应用进展[J].重庆医学,2020,49(17):2811-2815.
[3]于海江,于洋洋,于栋等.SARS-CoV-2、SARS-CoV-1及MERS-CoV的特征比较分析[J].基因组学与应用生物学,2020,39(09):4400-4404.
[4]黄媛媛,王宇,周承星等.呼吸道病毒核酸快速检测方案的建立与应用[J/OL].生物工程学报,20
23:1-12.
作者简介：邓博方，女，汉，山西省吉县，2000.01，本科，医学检验技术。
论文来源：2023届毕业论文

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