高危型人乳头瘤病毒核酸检测标准操作规程（PCR－荧光探针法）
1. 目的：规范高危型人乳头瘤病毒核酸检测操作流程，保证检测结果的准确性。
2. 应用范围：PCR实验室。
3. 职责：
3.1 文件编写：实验室技术员。
3.2 文件审核：实验室主管。
3.3 文件审批：实验室主任。
3.4 执行：PCR实验室所有工作人员。
4. 参考文献：
4.1《中山大学达安基因股份有限公司高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）说明书》
4.2《中山大学达安基因股份有限公司DA7600核酸序列检测系统用户手册》
5. 内容：
5.1 检测方法：PCR-荧光探针法。
5.2 实验原理：
用两对特异性引物和两条特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，通过PCR体外扩增法，即高温变性、低温退火、适温延伸进行DNA扩增，并对PCR全过程进行实时监测，从而定量检测常见高危型人乳头瘤病毒（16,18、31、33、45、52、56、58型）DNA。
5.3 性能参数：
5.3.1 检测下限： 5.0×102基因拷贝/ml。
5.3.2 线性范围：5.0×102～5.0×106基因拷贝/ml。
5.4 标本采集：由合作单位按照以下要求进行采集。
5.4.1 标本类型：泌尿生殖道分泌物棉拭子、生殖道刮片、组织活检标本等。
5.4.2 标本采集：
5.4.2.1 泌尿生殖道分泌物棉拭子：
5.4.2.1.1 男性尿道分泌物：用细小棉拭子伸入尿道约2～4厘米，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置于无菌试管中，密封送检（采集分泌物前2小时禁小便）。
5.4.2.1.2 女性生殖道分泌物：用无菌生理盐水棉球洗去宫颈外分泌物，再用宫颈刷或无菌棉拭子插入宫颈内，停5秒后旋动宫颈刷或棉拭子，采集宫颈分泌物，将宫颈刷或棉拭子置于无菌试管中，密封送检。
5.4.2.1.3 女性尿道分泌物：用无菌生理盐水棉球洗净尿道口，再用无菌棉拭子插入尿道约2厘米，捻动拭子采集分泌物，将棉拭子置于无菌试管中，密封送检。
5.4.2.2 生殖道刮片：用刮片刮取宫颈病灶处脱落细胞，置入无菌试管中，密封送检。
5.4.2.3 组织活检标本（包括宫颈组织、外阴组织、尖锐湿疣疣状组织等）：取可疑组织适量置于无菌试管中，密封送检。
5.4.3 标本保存：标本采集后保存于2～8℃。
5.4.4 运送条件：标本运送采用冰壶。
5.4.5 标本拒收标准：污染
5.5 设备和试剂：
5.5.1 设备： DA 7600荧光定量PCR仪、低速水平离心机、生物安全柜、台式高速离心机、移液器、混匀器、恒温水浴箱/干式恒温器、冰箱（4℃、-20℃）、移动/固定紫外灯。
5.5.2 试剂：
5.5.2.1 试剂品牌：《中山大学达安基因股份有限公司高危型人乳头瘤病毒（HR-HPV）核酸扩增（PCR）荧光检测试剂盒》。
5.5.2.2 试剂批准文号：国药准字 S2*******。
5.5.2.3 试剂组成：DNA提取液（500ul/管）2管，HR-HPV  PCR反应液（400ul/管）2管，Taq酶（60ul/管）1管，HR-HPV强阳性质控品（200ul/管）1管，HR-HPV临界阳性质控品（200ul/管）1管，HR-HPV阳性定量参考品（1.0×103基因拷贝/毫升），（10ul/管）1管红，HR-HPV阳性定量参考品（1.0×104基因拷贝/毫升），（10ul/管）1管黄，HR-HPV阳性定量参考品（1.0×105基因拷贝/毫升），
（10ul/管）1管蓝，HR-HPV阳性定量参考品（1.0×106基因拷贝/毫升），（10ul/管）1管绿。
5.5.2.4 试剂包装规格：单管单人份，20人份/盒。
5.5.2.5 试剂保存和有效期：保存于-20℃；有效期6个月。
5.6 操作过程：
5.6.1 标本与质控品的处理：
5.6.1.1 打开恒温水浴槽或加热器，设定温度 100℃。
5.6.1.2 从试剂盒中取出DNA提取液、DNA浓缩液、阴性质控品和自制阳性质控品，让其在室温下完全融化。
5.6.2  DNA提取：
5.6.2.1 质控品处理：分别取出HPV阴性、临界阳性、强阳性质控品，8,000rpm离心数秒，各加入50ul DNA
核酸检测结果阳性参考值阴性提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1min。12,000rpm离心5min，备用。
5.6.2.2 泌尿生殖道分泌物棉拭子：
5.6.2.2.1 向无菌试管中加入1ml灭菌生理盐水，充分振荡混匀，挤干棉拭子，
5.6.2.2.2 吸取全部液体转至1.5ml 离心管中，12,000rpm离心5min，
5.6.2.2.3 去上清，沉淀中加入50ul DNA提取液充分混匀，100℃恒温处理10±1min。
5.6.2.2.4 12,000rpm离心5min，备用。
5.6.2.3 生殖道刮片：
5.6.2.3.1 向无菌试管中加入1ml灭菌生理盐水，充分振荡混匀，

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