S0P_18-37新型冠状病毒2019-nCoV基因
(之江)扩增检测操作规程
1.名称
新型冠状病毒(2019-nCoV)RNA
2.目的
规范新型冠状病毒(2019-nCoV)RNA荧光定性PCR项目检测试验，确保检测结果的准确性和重复性。
3.方法核酸检测结果阳性参考值阴性
TaqMan探针实时荧光定性。
4.检测原理
本试剂盒采用RNA逆转录反应以及聚合福链式反应(PCR)结合Taqman技术，根据病毒的核酸序列设计特异性的引物用于扩增对应的核酸片段，同时，高度特异性的TaqMan探针可与对应的核酸片段进行结合，并在Taq酶外切酶活性作用下发生水解，产生荧光信号，根据荧光信号与扩增循环数之间的关系可得到实
时扩增曲线。
本试剂盒中以2019-nCoV的ORF1.ab基因，E基因和N
基因为检测对象，从而实现对2019-nCoV核酸的检测。
5.样品
咽拭子、痰液等
6.试剂
上海之江生物科技股份有限公司
注：不同批号的组分不可以互换使用。酶在使用前应低速离心数秒，以收集管壁或管盖残留成分。
其它组分使用前应在室温下融解，旋泯震荡数秒，充分混匀，低速离心数秒后使用。
7.仪器
苏州雅睿生物技术有限公司MA-6000实时荧光定量PCR 仪。
8.操作步骤
8.1PCR试剂准备(I区)
8.1.1从试剂盒中取出PCR检测混合液、RT-PCR酶、
内标，室温融化后振荡混匀，8,OOOrpm离心数秒后使用。
8.1.2取N个（N=待测样本个数+阴性对照品+阳性对照品）PCR反应管将各组分充分混合后进行短时离心，以使管壁上的液体全部离心至管底，之后将20u1.扩增体系分装到PCR管中。将装有PCR反应液的PCR管置I区〜II区传递窗。
NC单人份扩增体系配制如下表:
8.1.3试剂准备区清洁:
每次完成配液操作后，用75%的酒精清洁实验室台面，用2000mg/L含氯消毒剂清洁实验室地面，打开实验室紫外线，人员退出实验室。
8.2核酸模板提取（H区）
核酸提取：取200u1.液态样本进行核酸提取。采用西安天隆科技有限公司提供的核酸提取或纯化试剂盒；具体操作步骤请按照试剂盒说明书指引进行。
8.3加样（II区）
在配制好体系的PCR反应管中分别加入处理后的阴性对照品、待测标本核酸、阳性对照品各5u1.，盖紧管盖，
8,000rpm离心数秒后，置II区〜III区传递窗。
标本制备区清洁：每次完成试验操作后，医疗垃圾用2000mg/L含氯消毒剂喷洒至完全湿润，用鹅颈式封扎，带出二区高压处理后按规范处置。用75%的酒精清洁实验室台面，用2000mg/L含氯消毒剂清洁实验室地面，打开实验室紫外线，人员退出实验室。
8.4PCR扩增检测（HI区）
8.4.1将PCR反应管放入荧光PCR扩增仪进行扩增检测。
8.4.2循环参数设定：
8.4.3样品设置
在仪器软件的相应样品设置窗口内填写各样品的名称、类型。
9.基线和阈值设定
基线通常按照仪器自动设置的基线即可。基线调整原则：选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域，起点
（Start）避开荧光采集起始阶段的信号波动，终点（End）比最早出现指数扩增的样本Ct/Cq值减少1-2
个循环。阈值设定原则为阈值线刚好超过阴性对照品检测荧光曲线的最高点。
10.质控标准
10.1阴性对照品：FAM、VIC和RO*检测通道无明显扩增曲线，Cy5通道CT值＜35且具有S型扩增曲线。
10.2阳性对照品：FAM、VIC和R0*检测通道CT值W30且具有S型扩增曲线，Cy5通道有或无扩增曲线。
10.3应同时满足上述2项条件，否则试验无效。
10.4每批上样检测应当在剩余加样孔中设置1个弱阳性质控样本和三个阴性质控样本（2份生理盐水和1份阴性对照品）。3份阴性质控样本随机放在临床样本中间。弱阳性质控测定为阳性，3个阴性质控全部测定为阴性，视为在控。反之，则为失控，不可发出
报告，应分析原因，必要时重新检测样本。
H.结果判断
在质控品正常的情况下，结果判断如下：

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