解脲脲原体（UU）核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法）说明书
【产品名称】  通用名称：解脲脲原体（UU）核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)
英文名称：Detection Kit for Nucleic Acid of  Ureaplasma urealyticum (PCR-fluorescence probing)
【包装规格】  32人份/盒
【预期用途】  本试剂盒用于定性检测尿道、生殖道分泌物拭子样本中的解脲脲原体核酸成分，主要用于解脲脲原体感染的临床辅助诊断。 根据相关文献研究，解脲支原体有14 株脲原体标准血清型可分为微小脲原体（Ureaplasma parvum，UP）1、3、6、14 和解脲脲原体（Ureaplasma urealyticum，UU）2、4、5、7、8、9、10、11、12、13，其中UP为条件致病菌，致病性与其含量有关，且普通人也有携带少量UP。UU是引起非淋球菌性尿道炎、阴道炎等病症的主要致病菌之一，也是引起输卵管炎、盆腔炎、慢性前列腺炎、流产、产后热等的重要病原菌之一。目前，临床上常用的脲原体检测方法有液体培养和核酸检测，但其并不能鉴别出其病菌是UP还是UU。
【检验原理】  本试剂盒选用针对解脲脲原体（UU）特异性基因片段设计特异引物及特异Taqman荧光探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段DNA摸板发生特异性结合，在PCR延伸反应过程中，Taq酶的外切酶活性将5´端荧光基团从探针上切割下来，使之游离于反应体系中，从而脱离了3´端荧光淬灭基团的屏蔽，即能接受光刺激而发出可供仪器检测的荧光，从而实现在全封闭反应体系中对解脲脲原体（UU）核酸的自动检测核酸检测结果阳性参考值阴性，发出荧光信号的强度与UU-DNA的量呈正相关。
【主要组成成份】
序号
组分名称
装量
每个反应
体系用量
主要成份
1
核酸提取液
50μl
含NaCl、NaOH、EDTA、NP-40
2
PCR反应液
500ul
15μl
含Taq酶、UDG酶、10×buffer、dNTP
3
UU引物探针
120ul
μl
UU特异性引物和探针
5
MgCl2
350ul
μl
MgCl2、水
6
阳性对照
300ul
-
UU培养物
7
阴性对照
300ul
-
纯水
8
UU标准品1
10ul
-
质粒(106拷贝/μl)
9
UU标准品2
10ul
-
质粒(105拷贝/μl)
10
UU标准品3
10ul
-
质粒(104拷贝/μl)
11
UU标准品4
10ul
-
质粒(103拷贝/μl)
注：不同批号试剂盒中各组份不能互换。
【储存条件及有效期】  试剂应储存在-20℃保存，产品有效期为12个月，未使用完的试剂继续冷冻保存不影响其稳定性，但试剂反复冻融不得超过3次。
生产日期、有效期至：见标签字样。
【适用仪器】  具有FAM、JOE荧光检测通道的ABI 7300/7500、ABI 7500 Fast、LightCycler 480等实时荧光定量PCR仪。
【样本要求】
1． 使用藻酸钙拭子、普通棉拭子或涤纶拭子采集尿道、生殖道部位带柱状上皮细胞的分泌物样本，应当选用国家批准生产的一次性使用的男性拭子或女性拭子，拭子应当包括套管、棉签杆、塞子，棉签杆与塞子都应连接牢固。
1.1 尿道：对男性患者，先用生理盐水清洗尿道口，将男用取材拭子插入尿道内1-2cm，稍用力转动，保留数秒钟再取出，以采集到粘膜上皮细胞。对女性患者，可低着耻骨联合轻轻按摩尿道后，用同男性相似的方法取材。
1.2 宫颈：取材前用温水或生理盐水湿润扩阴器，应避免使用防腐剂和润滑剂。如果宫颈口外面的分泌物较多，先用无菌棉拭清除过多的分泌液，将女用取材拭子插入宫颈管内2-3cm，稍用力转动，保留数秒，采集阴道分泌物。
1.3 阴道：对于子宫切除的妇女和青春期前女孩可采用阴道样本。将取材拭子置于阴道后穹窿10-15s，采集阴道分泌物。如果处女膜完整，则从阴道口取材。
【检验方法】
1.样本处理（在样本处理区进行）： 
（1）标本中加入1ml无菌生理盐水，充分震荡摇匀，吸取200μl液体转至离心管中，12000rpm离心5分钟，弃上清取沉淀加入50μl核酸提取液，震荡混匀，100℃水浴或金属浴10min，12000rpm离心5min，吸取上清进行PCR扩增用（如样本裂解产物当天不使用，请于-20℃保存。）
（2）阴性对照、阳性对照直接取出100μl，12000rpm离心5分钟，弃上清取沉淀，加入50μl核酸提取液，震荡混匀后，100℃水浴或金属浴10min，12000rpm离心5min，备用。
注：若样本沉淀过少，吸取上清时需注意留少许底部液体。
2. 扩增试剂配制（试剂准备区）
从试剂盒中取出 PCR反应液、引物等，在室温下融化，振荡混匀，根据检测样本数准备反应试剂[n=样本数+7]。
取PCR反应液n×15ul，UU引物探针n×，去离子水 n×，加入一个离心管中震荡混匀后，2000rpm离心数秒，分别吸取28ul至PCR反应管中。
3. 加样（样本处理区）
分别加入样本2ul，标准品各2ul，阴性、阳性对照2ul，盖紧反应管，转移至检测区。
4. PCR扩增及荧光检测（PCR检测区）
  将各反应管按一定顺序放入PCR仪上，按以下程序进行PCR扩增：
步骤
循环数
温度
时间
1
UNG酶反应
1
50℃
2mim
2
预变性
1
95℃
2min
2
变性
5
95℃
15sec
退火，延伸
59℃
35sec
3
变性
35
95℃
15sec
退火，延伸
59℃
35sec
步骤中59℃时荧光检测，样本检测通道：FAM；内参检测通道：JOE。
【参考值（参考范围）】 
1.阳性对照的测定结果为阳性，且Ct≤32；
2.阴性对照的测定结果为阴性（Ct＞32）；
3.应同时满足上述2项条件，否则试验无效。
【检验结果的解释】    阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，阳性对照Ct值32，阴性对照Ct无数值；在阈值以上的荧光曲线应当是具有明显的S型曲线，否则该次实验视为无效，应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的误差。
1. Ct值＞32的样本判为阴性
2. Ct值≤32的样本判为阳性
【检验方法的局限性】  检测结果不能直接作为临床确诊或排除病例的依据，仅供临床医生参考使用。
【产品性能指标】
1. 灵敏度：本试剂盒的产品检测下限为100CCU/ml；
2. 特异性：本试剂盒与沙眼衣原体（CT）、淋球菌（NG）、HPV18型样本、微小脲原体、HCMV无交叉反应；
3. 批内精密度：高、中、低3个浓度水平的样本各连续重复10次检测，其批内精密度Ct值的CV值小于5%。
【注意事项】
1. 有关实验室管理规范请严格按照行业行政主管部门颁发的有关基因扩增检验实验室的管理规范执行。
2. 本试剂盒仅用于体外检测。
3. 实验室严格分区操作：
第一区：试剂准备区—准备扩增所需试剂
第二区：样本处理区—待检测样本和对照品的处理
第三区：PCR检测区—PCR扩增检测
4. 各区物品均为专用，不得交换使用，避免污染，每次实验完后立即清洁工作台。
5. 使用不含荧光物质的一次性手套、一次性专用离心管、自卸式移液抢和带滤芯吸头。
6. 反应液分装时应尽量避免产生气泡，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄露污染仪器。
7. 加样时应使样品完全加入反应液中，不应有样品粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖。
8. 扩增完毕请立即取出反应管，密闭在专用塑料袋中，放于指定地点，等待同一处理。
9. 实验中用过的吸头请直接打入盛有1%的次氯酸钠的废物缸内，并与其它废弃物品一同灭菌后丢弃。
10. PCR反应混合液应避光低温保存。
11. 不同批号的试剂请勿混用，并请在有效期范围内使用。
【参考文献】
1. 临床实验室定量测定室内质量控制指南
2. 临床基因扩增检验实验室管理暂行办法
3. Haggerty CL, Totten PA , Ferris M , et al . Clinical characteristics of bacterial vaginosis among women testing positive for fastidious bacteria. Sex Transm Infect, 2009, 85: 242 – 248.
4. Cao X, Wang Y , Hu X , Qing H , Wang H . Real-time TaqMan polymerase chain reaction assays for quantitative detection and differentiation of Ureaplasma urealyticum and Ureaplasmaparvum . Diagn Microbiol Infect Dis, 2007, 57: 373 –378.
5. Vancutsem E, Soetens O, Breugelmans M, Foulon W, Naessens A . Modified real-time PCR for detecting, differentiating, and quantifying Ureaplasma urealyticum and Ureaplasma parvum. J Mol Diagn, 2011, 13: 206 –212.
6. 赵缜，刘璐，赵芳，等.解脲脲原体相对定量方法的建立及临床应用.中国卫生检验杂志，2015，25（18）：3035-3040.
7. 刘璐，季育华，赵缜，等. parC检测在解脲支原体基因分型中的临床应用.中华微生物学与免疫学杂志，()2011，31（9）：843-846.
【基本信息】
注册人名称：上海生物科技有限公司
住所：大连路1079号603室    邮编： 200086
：    传真：
售后服务单位名称：上海生物科技有限公司
生产企业名称：上海生物科技有限公司
生产地址：上海市青浦区    号3幢5楼  邮编： 201707
：021-59        传真：021-   
【医疗器械生产企业许可证编号】 沪食药监械生产许        号
【医疗器械注册证书编号】
【产品技术要求编号】
【说明书批准及修改日期】 2015年  1月11日

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