沙眼衣原体核酸检测试剂盒（PCR-荧光探针法）
【名称】
通用名称：沙眼衣原体核酸检测（PCR-荧光探针法）
英文名称：Diagnostic  for  Chlamydia  Trachomatis  DNA  (PCR—Fluoresecence  Probing)
【包装规格】20人份/盒
【预期用途】
    本产品用于尿道或女性阴道分泌物标本中的沙眼衣原体核酸定性检测，适用于沙眼衣原体（CT）感染的辅助诊断，不能用于沙眼衣原体感染的筛查，仅限用于经卫生行政机构认可的医疗单位的试验室。
【检验原理】
本产品用一对沙眼衣原体特异性引物和沙眼衣原体特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热dn
a聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法检测沙眼衣原体DNA。
【主要组成成份】
核酸检测结果阳性参考值阴性
组份部分
数量
主要组成成份
DNA提取液（500μl/管）
2管
NaOH、Tris—HCl(PH8.0)、TritonX—100、NP—40、EDTA(PH8.0)、Chelex—100
PCR反应管/盖（未贴标签）
20管
CT-PCR反应液、Taq酶系和固体封盖剂
阴性质控品（250μl/管）
1管
无菌生理氯化钠溶液
临界阳性质控品（50μl/管）
1管
灭活的CT培养液（25个CT颗粒/μl）
强阳性质控品（50μl/管）
1管
灭活的CT培养液（2500个CT颗粒/μl）
【储存条件及有效期】于–20℃，避免反复冻融；有效期6个月。
【适用仪器】DA—620荧光检测仪，ABI  Prism 7000，ABI  GeneAmp 5700，Roche LightCycler、Mx3000P荧光定量PCR仪等。
【样本要求】
男性：取尿道分泌物或细小棉拭子伸入尿道约2～4厘米，略捻动拭子取出分泌物（应略带黏膜）。将分泌物或棉拭子置入无菌玻璃管，用无菌棉球将试管塞紧后，密闭送检。
女性：阴道-用无菌生理氯化钠溶液棉球洗去宫颈外分泌物，再用无菌棉拭子插入宫颈内，停5秒钟后旋动棉拭子采集宫颈分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃管，用无菌棉球将试管塞紧后，密闭送检。
尿道—用无菌生理氯化钠溶液棉球洗净尿道口，再用无菌棉拭子插入尿道约2厘米，略捻拭子取出分泌物，将棉拭子置入无菌玻璃管（应略带黏膜）。用无菌棉球将试管塞紧后，密闭送检。
标本可立即用于测试，也可保存于－20℃待测，保存期为6个月。标本运送应采用0℃冰壶。
并于48小时内送达。
【检验方法】
标本及对照品的处理
标本试管中加入1ml无菌生理氯化钠溶液1ml打匀，12,000转/分离心5分钟，再重复洗涤一次。沉淀直接加50μlDNA提取液充分混匀，（提取液内含不溶于水的物质，取样时需用加样器充分混匀后吸取。如出现因吸头嘴部太细不能吸取或取样后堵塞吸头的现象，可先用洁净无污染的剪刀将吸头嘴部剪去一截。）沸水浴10分钟（误差不超过1分钟），转至4℃静置6～8小时以保证充分裂解。12,000转/分离心2分钟，取上清液2μl做PCR反应。另取阴性质控品、阴性质控品各50μl加等量DNA提取液充分混匀，沸水浴10分钟后同上处理。
2PCR扩增
2.1DA-620仪器荧光检测操作
取单管单人份PCR反应管若干管，直接加入处理后样品（或阴性质控品、阳性质控品）2μl，,6,000转/分离心数秒。将反应管放入PCR仪，按下列条件扩增：
93℃预变性2分钟，然后按93℃ 45秒→55℃ 120秒，反应10个循环后置33℃保温，迅速逐个将反应管放入荧光检测仪，读取并记录读数AO。荧光激发波长为487nm，检测波长为525nm。最后按93℃ 45秒→55℃ 120秒，共做30个循环后置33℃保温。使用PE 9600,9700,2400仪器循环参数为93℃ 30秒→55℃ 60秒，其它仪器循环参数为93℃ 45秒→55℃ 120秒。
PCR反应后荧光检测，待各PCR管充分冷却至33℃后，迅速逐个将反应管放入荧光检测仪，读取并记录读数AI。荧光激发波长为487nm，检测波长为525nm。
2.2ABI  Prism 7000，ABI  GeneAmp 5700操作
将反应管放入PCR仪器的孔反应槽内，按对应顺序设置阴性质控品、阳性质控品以及未知标本，并设置样品名称、标记荧光基团种类和循环条件：ABI  Prism 7000，ABI  GeneAmp 5700的循环条件：93℃预变性2分钟，然后按93℃ 45秒→55℃ 60秒，先做10个循环，最后按93℃ 30秒→55℃ 45秒，做30个循环。
3Roche LightCycler操作
将处理后的样品（或阴性质控品、阳性质控品）2μl加入专用毛细管中，盖上PCR反应盖8,000转/分离心2分钟，插入圆形卡盘倒置10秒钟后放入仪器中设置循环条件：93℃预变性2分钟，然后按93℃ 5秒→57℃ 45秒，做40个循环.所有设置全部完成后保持稳健，最后运行程序。
4结果分析条件的设定
DA-620的条件设置：计算：Ax=A1-A0。将阴性质控品管的Ax称为N，临界阳性质控品的Ax值称为P1，强阳性质控品的Ax称为P2。
ABI  Prism 7000、ABI  GeneAmp 5700的条件设置：反应结束后自动保存检测数据文件。根据分析后图像调节baseline的start值（2～4），stop值（7～9）以及Threshold值，使阴性质控品Ct值为30，临界阳性质控品Ct值为22～24，强阳性质控品Ct值为8～10，最后记录Reporter窗口下记录仪器自动分析计算出的Ct值。
Roche LightCycler的的条件设置：反应结束后自动保存检测数据文件，调整荧光记数值（Fluorescence）为F1/F2，点击Quantification读取结果。调节噪声容限，使阴性质控品Ct
值为40，临界阳性质控品Ct值为32～34，强阳性质控品Ct值,18～20，最后记录仪器自动分析计算出的Ct值。
【检验结果的解释】
DA-620仪器：在试验有效的前提下，样品Ax值＞N=0.6×（P1-N）≥Ax≥N+0.4×（P1-N）则属于试验灰度区，需重复试验一次，若重复试验结果Ax值≥N+0.4×(P1-N)判为阴性。
ABI  Prism 7000，ABI  GeneAmp 5700，Roche LightCycler仪器：
    阴性结果判定：
        ABI  Prism 7000，ABI  GeneAmp 5700仪器：如果Ct值=30，则实验结果为阴性。
        Roche LightCycler仪器：如果Ct值=40，则实验结果为阳性。
        ABI  Prism 7000，ABI  GeneAmp 5700仪器：如果27≤Ct值＜30，则为试验灰度区，需重复试验一次，若重复试验结果Ct值＜30判为阳性，否则判为阴性；
      Roche LightCycler仪器：如果37≤Ct值＜40，则为试验灰度区，需重复试验一次，若重复试验结果Ct值＜,40判为阳性，否则判为阴性。
【产品性能指标】
使用企业参考品检定。
1阳性参考品符合率：检测结果应全部为阳性。
2阴性参考品符合率：检测结果应全部为阴性。
3最低检出量：10个CT颗粒/μl。
4精密性：CT值的CV＜10%。

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