【讨论】细数一下新冠病毒核酸检测的“假阳性”与假阴性“原因
4月6日，成都医学院贾旭、中国医学科学院输血研究所何苗联合资阳市第一人民医院林胜在MedRxiv上发表了一篇论文，题为“A case of SARS-CoV-2 carrier for 32 days with several times false negative nucleic acid tests”，报道了一例连续32天检测假阴性的新冠病毒携带者。
真的是“神了奇”了！
目前，RT-PCR方法的检测以SARS-CoV-2 基因组中开放读码框lab（Open reading frame 1ab,ORF-lab）、核壳蛋白（Nucleocapsid, N）基因 和（或）包膜蛋白（Envelop,E）基因等作为检测靶标。
２０２０年２月２１日国家卫健委发布的《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》中强调，确诊病例需满足同一份标本中SARS-CoV-2的ORF-lab及Ｎ 基因的２个靶标RT-PCR检测均为阳性，或２种类型标本的RT-PCR同时出现单靶标阳性，或同种类型标本２次采样的RT-PCR均出现单靶标阳性。
然而，临床实践中并非所有COVID-19 患者均可通过常规采样标本检测出SARS-CoV-2核酸。
按照第五版实验室检测技术指南的要求，每例疑似病例和聚集性病例均须采集急性期上呼吸道或下呼吸道标本；重症病例优先采集深咳痰液、肺泡或支气管灌洗液等下呼吸道标本。但由于多数COVID-19 患者咳痰及下呼吸道标本取样操作困难，且生物安全风险极大。因此，临床常规采集的呼吸道标本仍以鼻、咽拭子为主；而拭子样本采用现有RT-PCR试剂，阳性检出率仅为３０％～５０％，大量的“假阴性” 结果无法避免。目前，全国各地多家医疗机构均出现过SARS-CoV-2 核酸检测“假阴性”的案例，甚至有的确诊病例先前的多次核酸检测均呈阴性，致使实验室检查与临床症状、影像学特征不相符，严重影响临床诊疗，甚至延误整体的疫情防控。相对于假阴性，假阳性则较少见。
那么新冠病毒核酸检测的假阴性/假阳性有哪些原因呢？下面就整体分析一下，有什么不足的希望批评指正！
1、核酸检测“假阴性”原因：
PCR反应中任何环节出现问题都可能导致假阴性结果，应从PCR反应的关键环节中到原因，比如：模板核酸的制备、引物的质量与特特性、酶的质量及活性、PCR反应条件、PCR反应产物鉴定等等。以下为一些新冠病毒检测假阴性的原因分析：
核酸检测结果阳性参考值阴性①、检测试剂的有效性:
前期，由于疫情形势的严重性和紧迫性，现有核酸检测试剂盒多数经国家药监局应急审批程序紧急批准上市，这种举措虽然有效地缓解了疫情防控工作中因检测试剂不足导致似病例无法尽早确诊的问题，但也因缺乏足够的时间对检测试剂进行先期临床试验，不可避免地存在部分产品的有效性难以保证。
比如纯化问题：影响核酸提取纯化的因素包括裂解效率、中和沉淀、结合效率、洗脱效率。同时，洗脱产物若含太高的盐分或乙醇会抑制后续的PCR反应。对于含有免疫细胞的标本里含有RNase或者使用的耗材、缓冲液含有环境中的RNase，导致RNase污染；新冠病毒是单链RNA，GuHCI或GuSCN中易降解，不易暴露时间过长。
由于引物或探针降解、引物或探针设计不合理而造成的CT值出现过晚或无 CT信号出现。优化方案是设计更好的引物或探针；优化引物浓度和退火温度。 避免引物或探针降解，可在进行实时定量 PCR 实验前通过电泳检测其完整性。
逆转录酶：与Taq酶相比，逆转录酶相对脆弱，活性保持或获得高活性的逆转录酶相对不易。纯化制品中可能存在RNase污染。
引物探针设计局限：目前，RT-PCR方法的检测以SARS-CoV-2 基因组中开放读码框lab（Open reading frame 1ab,ORF-lab）、核壳蛋白（Nucleocapsid, N）基因 和（或）包膜蛋白（Envelop,E）基因等作为检测靶标。但是病毒存在变异的可能，而这个突变点可能及存在探针上。因此，需要设置阴性和阳性对照品，目前已见报道有公司申报注册的试剂中，阳性对照包含ORF-1ab基因、N基因、内标基因扩增序列的假病毒，可以模拟样品中病毒核酸的原始状态，能够准确监控提取、逆转录、荧光定量检测全过程。
②、采样方式与时机：
为提高检出率，对于肺炎患者通常选取下呼吸道标本，从而获得更高的病毒载量。鼻、咽拭子作为最普遍的采样方式，其检出率与病毒感染的进程密切相关。以甲型流感为例，一般在发病２４～７２ｈ内，病毒在鼻、咽部的载量达到高峰，随后迅速下降。由于目前临床上对SARS-CoV-2感染后鼻、咽部采样的最佳时机尚无定论，尤其是个别病例潜伏期长，就诊时可能已经迁延数天甚至数周，是否为鼻、咽部采样的最佳时期，标本内病毒载量是否仍在检测阈值范围内均无法确定，从而造成检测的“假阴性”。
③、病毒变异可能：
考虑到SARS-CoV-2属于不稳定、易变异的RNA 病毒，针对其变异频率及突变热点等问题暂时难以进行大规模临床样本的验证，故存在个别病例扩增区突变而导致“假阴性”的可能。此外，现有核酸检测试剂盒大多靶向PRF1ab及Ｎ 基因，不同双位点RT-PCR试剂对于Ｎ基因的扩增灵敏度普遍高于PRF1ab基因，且细胞内病毒Ｎ基因ｍRNA 的拷贝数也远高于PRF1ab基因；但Ｎ基因的保守程度却不及PRF1ab基因，推测其为Ｎ基因单靶标阳性比例高于PRF1ab基因的原因。
④、标本保存与运输：
RNA 病毒稳定性差，标本通常须存放在专用保存液中，以４℃或以下温度保存，并尽快送检。由于多数医疗机构在标本采集后需送至各地疾控中心统一检测，或因检测单位人力、能力等问题造成个别标本从采样到实际检测可能已经超过了检测最佳时限，导致结果出现“假阴性”。而且保护剂不合适，如保存液导致病毒颗粒沉淀、盐分太高导致裂解液无法释放病毒核酸等，也会受影响。
⑤、方法学因素：
RT-PCR检测的影响因素较多，如标本核酸提取或纯化过程出现的扩增反应抑制物、扩增仪孔间温度差异等。操作对实验室人员技术要求较高。不规范操作可导致核酸提取效率与纯度不佳、RNA质量良莠不齐，均可导致“假阴性”结果。
比如操作不当导致核酸降解，而作为RNA病毒的新冠病毒又是单链RNA；细胞内源RNase或者实验室空气气溶胶里携带的RNase等都可能导致降解。
2、核酸检测“假阳性”原因：
早在2月5日，危重医学专家、中国医学科学院院长王辰院士在接受央视采访时说：“并不是所有的病患都能检测出核酸阳性，对于真实新型冠状病毒感染的病人，也不过只有30%-50%的阳性率。”
而在采访李金明教授“2019-nCoV核酸检测会不会出现’假阳性’？”时，李金明教授说道：“从前面的引物和探针设计的原理看，从理论上是不应该有假阳性的，并且试剂在批准过程中，也经过了分析特异性的性能确认（validation），所以，从方法学上看，是不会有假阳性的。但实际工作中，还是有可能出现检测的“假阳性”，通常是由于实验室检测人员操作时，发生
了标本间交叉污染（cross-contamination）或实验室扩增产物的遗留污染（carry-over）所致。一个临床实验室如果严格执行’三个阴性样本随机放在临床样本中间同时参与检测全过程’的质控策略，应可有效避免病毒核酸检测假阳性结果的报出，这也是病毒核酸检测阳性可以作为新冠病毒感染的确诊依据之所在。”
假阳性，大多是由于样本污染或者检测过程中的污染导致。缺少严格控制调价的实验室环境、不专业的检测操作，以及样本本身的污染，都会导致假阳性。
①、样品间交叉污染：
样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本造成相互间污染，样本核酸模板在提取过程中，由于吸样污染导致标本间污染。
②、PCR试剂污染：
主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于加样、容器、双蒸水以及其他溶液被PCR核酸模板污染。
③、PCR扩增产物污染：
这是PCR种最主要、最常见的污染问题。PCR产物拷贝量大（一般大于1013copy/mL），远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。
④、气溶胶污染：
在空气与液体面摩擦是就可形成气溶胶，在操作是比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算，一个气溶胶颗粒可含48000个拷贝，因而由其造成的污染是一个特别重视的问题；而有些微生物尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。
⑤、实验室中克隆质粒的污染：
由于克隆质粒在单位容积含量相当高，另外在纯化过程中需要较多的用具及试剂，而且在活细胞内质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题比较常见。
3、讨论：
目前，COVID-19 最常用病原学检查仍然是采用RT-PCR技术的核酸检测，临床上对于核酸检测为阴性或阳性的病例需谨慎对待，应充分考虑到各环节中可能造成结果不准确的因素。保证试剂盒质量、规范采样／保存／运输流程，提高实验室人员技术水平、优化检测流程、规范实验室设计及试剂耗材管理 等均可作为提高核酸检测准确性的有效手段，亦是目前疫情防控工作的关键。
对于实验过程中产生的“污染”问题，可进行一些以下适当的监测：
①、阳性对照：
在建立PCR实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照，它是PCR反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志，阳性对照要选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高(100个拷贝以下），但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大，因而当某一PCR试剂经自己使用稳定，检验人员心中有数时，在以后的实验中可免设阳性对照。
②阴性对照：
每次PCR试验务必做阴性对照，它包括：标本对照，被检标本是血清就用鉴定后的正常血清做对照，被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞做对照；试剂对照，在PCR试剂中不加模板DNA或RNA,进行PCR扩增，以检测试剂是否污染。
③、重复性实验；
④、选择不同区域的引物进行PCR扩增；
以上就是分析，欢迎各位战友讨论，提出宝贵意见！
参考资料：
1、《新型冠状病毒实验室检查方法的应用现状及结果解读》（吴嘉，汪俊军，CNKI）；
2、《PCR理论与技术》第二版（王廷华）；
3、《PCR最新技术原理、方法及应用》第二版（黄留玉）；

版权声明：本站内容均来自互联网，仅供演示用，请勿用于商业和其他非法用途。如果侵犯了您的权益请与我们联系QQ:729038198，我们将在24小时内删除。