·方法研究
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新型冠状病毒不同核酸检测方法
在临床应用中的评价
代芳芳，娄金丽，于艳华，张立丽，陈　铭
（首都医科大学附属北京佑安医院检验科，北京１０００６９）
ＤＯＩ：１０．１１７４８／ｂｊｍｙ．ｉｓｓｎ．１００６－１７０３．２０２０．１１．０３１收稿日期：２０２０ ０８ １９；修回日期：２０２０ ０９ ２９
基金项目：国家科技重大专项课题（十三五课题） 艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治 基于宏基因组学的感染性疾病病
原体临床诊断技术研究（编号：２０１８ＺＸ１０３０５ ４１０ ００６）
作者简介：代芳芳（１９８６—），女，硕士，主治检验医师。主要从事临床检验诊断学研究。通讯作者：
娄金丽。Ｅ ｍａｉｌ：ｌｏｕｊｉｎｌｉ＠１６３．ｃｏｍ
摘要：目的　探讨和评价新型冠状病毒（ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２）不同核酸检测方法在临床工作中的应用。方法　对２０２０年２月中旬送检的７６例咽拭子标本及５例痰标本同时分别用一步ＲＴ ＰＣＲ法及ＮＡＳＢＡ（ｎｕｃｌｅａｒａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）恒温扩增芯片法进行２０１９ ｎＣｏＶ核酸检测。结果　８１例患者中确诊ＣＯＶＩＤ １９的有５１例，实时荧光一步ＲＴ ＰＣＲ法检测阳性２
１例（２５．９３％），ＮＡＳＢＡ恒温扩增芯片法检测阳性１１例（１３．５８％）。实时荧光一步ＲＴ ＰＣＲ法在诊断ＣＯＶＩＤ １９中灵敏度（０．４１２）高于ＮＡＳＢＡ恒温扩增芯片法（０．２１６），阴性预测值（０．５００）高于恒温扩增法（０．４２９），诊断准确性（ＹＩ＝０．４１２）高于恒温扩增芯片法（ＹＩ＝０．２１６），两种方法的特异性和阳性预测值均为１００％。两种方法单次检测的假阴性率分别为５８．８２％和７８．４３％。结论　新型冠状病毒（ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２）不同核酸检测方法之间灵敏度差异较大，应用前要对检测方法和试剂盒进行性能评价，两种核酸检测法的特异性和阳性预测值均很高，但单次核酸检测结果假阴性率较高，临床诊断时应综合考虑。
关键词：２０１９ ｎＣｏＶ；　ＣＯＶＩＤ １９；　ＰＴ ＰＣＲ；　恒温扩增法中图分类号：Ｒ３７３．９  文献标识码：Ａ
ＡｎＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＤｉｆｆｅｒｅｎｔＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＤｅｔｅｃｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｓ
ｏｆＮｏｖｅｌＣｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｉｎＣｌｉｎｉｃａｌＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ＤＡＩＦａｎｇｆａｎｇ，ＬＯＵＪｉｎｌｉ，ＹＵＹａｎｈｕａ，ＺＨＡＮＧＬｉｌｉ，ＣＨＥＮＭｉｎｇ
（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＢｅｉｊｉｎｇＹｏｕ′ａｎＨｏｓｐｉｔａｌ，ＣａｐｉｔａｌＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００６９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆａｎｏｖｅｌｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ（ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２）ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．
ＭｅｔｈｏｄｓＳｅｖｅｎｔｙ ｓｉｘｓａｍｐｌｅｓｏｆｐｈａｒｙｎｇｅａｌｓｗａｂｓａｎｄｆｉｖｅｓｐｕｔｕｍｓａｍｐｌｅｓｆｒｏｍＦｅｂｒｕａｒｙ，２０２０ｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄｂｙｏｎｅ ｓｔｅｐＲＴ ＰＣＲａｎｄＮＡＳＢＡ（ＮｕｃｌｅａｒＡｃｉｄＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｂａｓｅ
ｄＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）ｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ２０１９ ｎｃｏｖｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ，ａｎｄｔｈｅｓｅｒｕｍｓａｍｐｌｅｓｏｆｔｈｅｐａｔｉｅｎｔｓｗｅｒｅｔｅｓｔｅｄｂｙＳＡＲＳ ＣｏＶ ２ＩｇＭａｎｄＩｇＧａｎｔｉｂｏｄｙｔｏｄｉａｇｎｏｓｅＣＯＶＩＤ １９．Ｒｅｓｕｌｔｓ５１ｏｆｔｈｅ８１ｐａｔｉｅｎｔｓｗｅｒｅｄｉａｇｎｏｓｅｄｗｉｔｈＣＯＶＩＤ １９ｐｏｓｉｔｉｖｅ，２１（２５．９３％）ｗｅｒｅｐｏｓｉｔｉｖｅｂｙｒｅａｌ ｔｉｍｅｏｎｅ ｓｔｅｐＲＴ ＰＣＲａｎｄ１１（１３．５８％）ｗｅｒｅｐｏｓｉｔｉｖｅｂｙＮＡＳＢＡ
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１９，ｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ（０．４１２），ｎｅｇａｔｉｖｅｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅｖａｌｕｅ（０．５００）ａｎｄｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａｃｃｕｒａｃｙ（ＹＩ＝０．４１２）ｏｆｔｈｅｏｎｅ ｓｔｅｐｒｅａｌ ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＲＴ ＰＣＲｍｅｔｈｏｄｗｅｒｅ
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３
７９１标记免疫分析与临床　２０２０年１１月第２７卷第１１期
ＡｓｆｏｒｔｈｅＣＯＶＩＤ １９ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｈａｓａｈｉｇｈｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙａｎｄｐｏｓｉｔｉｖｅｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅｖａｌｕｅ，ｂｕｔｔｈｅｆａｌｓｅｎｅｇａｔｉｖｅｒａｔｅｏｆｔｈｅｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｉｓｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｈｉｇｈ．Ｃｌｉｎｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓｓｈｏｕｌｄｂｅｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｌｙｔｏｃｈｏｏｓｅｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｍ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２；　ＣＯＶＩＤ １９；　ＰＴ ＰＣＲ；　Ｃｏｎｓｔａｎｔｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
  ２０１９年１２月以来，湖北省武汉市陆续发现了多例新型冠状病毒肺炎患者，随着疫情的蔓延，我国其他地区也相继发现了此类病例［１］。自疫情爆发以来，北京发现的ＣＯＶＩＤ １９患者也逐渐增多，我院作为北京市级定点新型冠状病毒肺炎患者收治医院，肩负着准确检出ＣＯＶＩＤ １９患者和排除疑似患者的艰巨任务。ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２核酸检测对确诊和排查疑似病患，防止疫情的传播和蔓延起到至关重要的作用［２］。因此ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２核酸检测试剂的性能评价非常重要，本研究针对两种核酸检测试剂进行评价，探讨其在临床诊断中的应用情况。
材料和方法
  １　研究对象
  ２０２０年２月中旬送检咽拭子及痰标本的８１例疑似的ＣＯＶＩＤ １９患者，其中门诊患者１２人，住院患者６９人，年龄１５～９１岁，诊断标准符合《新型冠状病毒感染肺炎的诊疗方案（试行第七版）》，确诊病例实时荧光ＲＴ ＰＣＲ核酸检测均为阳性。
  ２　方法
  ２．１　标本采集　口咽拭子：用两根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子同时擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，将拭子头浸入３ｍＬ采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。鼻咽拭子：用１根聚丙烯纤维头的塑料杆拭子伸入鼻道内鼻腭处停留片刻，缓慢转动退出，取另一只拭子采用同样方法采集另一侧鼻孔标本，上述两根拭子浸入３ｍＬ采样液的管中，尾部弃去，旋紧管盖。痰液：将咳出的痰液收集于３ｍＬ采样液样品管中。标本采集参考《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南（第二版）》。
  ２．２　标本检测　２０１９ ｎＣｏＶ核酸检测采用实时荧光ＰＣＲ法和ＮＡＳＢＡ恒温扩增芯片法两种方法。实时荧光ＰＣＲ法以ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２的ＯＲＦＬａｂ和Ｎ基因设计特异性引物和ＴａｑＭａｎ探针通过荧光定量ＰＣＲ仪进行扩增检测，本研究使用上海伯杰医疗科技有限公司生产的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，操作按照试剂盒说明书进行，使用赛默飞ＡＢＩ７５００ＰＣＲ扩增仪进行扩增检测。ＮＡＳＢＡ恒温扩增芯片法使用成都博奥晶芯生物科技有限公司的六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒（恒温扩增芯片法），完全按照说明书进行新型冠状病毒核酸检测，仪器为配套ＲＴｉｓｏｃｈｉｐＴＭ Ａ恒温扩增微流控芯片核酸分析仪。  ３　统计学处理
  采用ＳＰＳＳ１７．０软件进行统计分析，计数资料用χ２检验分析，检验水准α＝０．０５，Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义，用诊断试验准确性评价指标进行诊断试验评价。
结  果
  １　ＲＴ ＰＣＲ法和ＮＡＳＢＡ恒温扩增芯片法对２０１９ ｎＣｏＶ核酸检出情况分析
  ８１例患者中确诊ＣＯＶＩＤ １９的有５１例（经多次ＲＴ ＰＣＲ２０１９ ｎＣｏＶ核酸检测呈阳性后确诊），实时荧光一步ＲＴ ＰＣＲ法单次检测阳性２１例（２５．９３％），ＮＡＳＢＡ恒温扩增芯片法单次检测阳性１１例（１３．５８％）。ＲＴ ＰＣＲ法检测阳性率高于恒温扩增芯片法（Ｐ＝０．０２１）。两种方法检测结果的吻合程度κ＝０．３９２，Ｐ＜０．００１，吻合度有统计学意义，但两者吻合度较弱。
  ２　两种方法诊断试验的评价情况
  实时荧光ＲＴ ＰＣＲ法在诊断ＣＯＶＩＤ １９中灵敏度（０．４１２）、阴性预测值（０．５００）、诊断准确性（ＹＩ＝０．４１２）均高于恒温扩增芯片法０．２１６、０．４２９、ＹＩ＝０．２１６。两种方法的特异性和阳性预测值均为１００％。实时荧光ＲＴ ＰＣＲ法和恒温扩增芯片法单次检测的假阴性率分别为５８．８２％和７８．４３％。见表１，表２。
表１　两种方法在病例组（确诊ＣＯＶＩＤ １９）与非病例组
（排除ＣＯＶＩＤ １９）数据情况（ｎ）
方法病例组（５１）非病例组（３０）ＲＴ ＰＣＲ法２１３０恒温扩增芯片法１１３０
表２　两种方法诊断试验的评价情况
评价指标
方法
ＲＴ ＰＣＲ法恒温扩增芯片法灵敏度０．４１２０．２１６
特异性１．０００１．０００
阴性预测值０．５０００．４２９
阳性预测值１．０００１．０００
假阴性率０．５８８０．７８４
假阳性率０．００００．０００约登指数（ＹＩ）０．４１２０．２１６
４
７
９
１ＬａｂｅｌｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ＆ＣｌｉｎＭｅｄ，Ｎｏｖ．２０２０，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．１１核酸检测结果阴性是什么意思
讨  论
  随着对ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２认识的不断加深，对ＣＯＶＩＤ １９的诊疗方案也在不断更新和完善。目前我国已经更新到了《新型冠状病毒感染肺炎的诊疗方案（试行第七版）》。其中对新型冠状病毒感染肺炎的确诊依然依赖于实验室的病原学检测，主要包括实时荧光ＲＴ ＰＣＲ新型冠状病毒核酸检测阳性或通过基因测序与已知新型冠状病毒高度同源，同时血清学间接病原学抗体检测作为辅助诊断。病原学核酸检测为确诊的金标准，常规ＲＴ ＰＣＲ等核酸检测方法相较于基因测序简便快捷且成本较低［３ ５］，实时荧光ＲＴ ＰＣＲ法为目前确诊ＣＯＶＩＤ １９指标之一。恒温扩增芯片法虽未被列为ＣＯＶＩＤ １９的确诊方法，但作为筛查方法被批准入市，其能对包括２０１９ ｎＣｏＶ在内的六项呼吸道病毒核酸进行检测，方便对ＣＯＶＩＤ １９及时进行快速大量人新型冠状病毒排查。目前我国已陆续应急审批了国内数家新型冠状病毒核酸检测产品，因为在短时间内批准上市，试剂盒的检测性能仍有待进一步的评价和验证。
  我院作为北京市属新型冠状病毒肺炎患者收治医院，承担着北京大部分新型冠状病毒肺炎患者的收治
工作。自开展新型冠状病毒核酸检测工作以来，根据北京市疾病预防控制中心的推荐，采用上海伯杰医疗科技有限公司生产的新型冠状病毒核酸检测试剂盒ＲＴ ＰＣＲ法进行ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２的检测，自博奥晶芯生物科技有限公司的六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒恒温扩增芯片法批准上市以后，我们对两种ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２核酸检测方法进行了比较。经研究发现，ＲＴ ＰＣＲ法的阳性检出率高于恒温扩增芯片法，且其阴性预测值和诊断准确性均高于恒温扩增芯片法。说明不同核酸检测方法间差异较大，因此非常有必要对ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２检测试剂盒进行性能评价，以选择诊断性能较好的方法进行临床试验。两种方法假阴性率均高于５０％，提示单次ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２核酸检测有较高的漏诊率，对于疑似ＣＯＶＩＤ １９者，不可依靠单次ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２核酸检测阴性就排除诊断，应进行多次核酸检测或血清学检测来诊断，本研究中确诊病例大多数经过多次核酸检测才呈阳性或后期经血清学检测确诊。因此在排查ＣＯＶＩＤ １９时，多次核酸检测或同时联合血清学抗体检查能够减少漏诊情况。虽然核酸检测存在漏诊情况，但两种核酸检测方法的特异性和阳性预测值均为１００％，假阳性率均为０，误诊率也均为０，再次说明核酸检测在ＣＯＶＩＤ １９诊断中具有不可替代的作用。
  对于ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２核酸检测漏诊率较高的问题，除了检测方法和试剂盒本身的因素外，标本质量也是关键性环节［６ ７］。临床上一般多送检容易采集的上呼吸道标本，上呼吸道标本的质量因采集方法和采样人员的不同多参差不齐，ＣＯＶＩＤ １９病变多在下呼吸道，理论上下呼吸道深部痰液或肺泡灌洗液更有意义。但基于深部痰液不易留取或肺泡灌洗液采取困难，同时需要进行大量人的筛查，采
集上呼吸道标本更简便易行，但采集标本质量的好坏直接影响检测结果。因此应培训采样人员严格按照标本采集指南规范操作，以提高采集标本质量，从而提高核酸检测结果的准确性。
  综上所述，作为病原学直接检测指标ＳＡＲＳ ＣｏＶ ２核酸检测在新型冠状病毒肺炎防治过程中具有不可替代的作用，但在临床大规模应用前仍需优化各类检测技术，进行比对验证。同时需加强实验室质量管理，规范标本采集和实验室操作，以为临床提供更加准确可靠的检测结果，为疫情防控提供有价值的指导［８］。
参考文献
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５
７
９
１
标记免疫分析与临床　２０２０年１１月第２７卷第１１期

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