中国生物工程杂志 China BioteChnok)gy，2〇2〇,4〇(11):28_34
DOI：10. 13523/j.cb.2008124技术与方法I
双链探针实时荧光P C R核酸检测新技术研究
刘丽艳^刘琪琦1 **张影2王升启1SMt*
(1军事医学研究院辐射医学研究所北京100850 2郑州美灵生物技术有限公司郑州450000)
摘要目的：采用一种“双链探针”实时荧光PC R技术，提高H BV核酸检测灵敏度，并在同一反应
管中实现代谢酶CYP2C19-2基因型检测。方法：采用双链探针与TaqM an探针同时检测不同浓
度H B V血清样本，使用上海宏石SLAN96实时荧光PC R仪进行核酸C t值检测和结果统计分析；
采用双链探针检测代谢酶CYP2C19-2不同基因型样本，使用上海宏石SLAN96实时荧光P C R仪
进行核酸C t值检测和基因型确定。结果：不同浓度HBV血清样本检测，双链探针荧光本底低，检
测灵敏度更高，与TaqMan探针检测结果相比，两者核酸检测C t值存在显著性差异（Z5< 0. 05 )；双
链探针检测36份样本的代谢酶CYP2C1V2基因型，检测结果与S anger测序结果完全一致。结 论：双链探针实时荧光P C R检测技术可完成目的基因的高灵敏核酸检测，也可实现基因型分析。
关键词双链探针TaqM an探针实时焚光PCR 中图分类号Q819
1996年由美国Applied Biosystems公司推出了实时
焚光定量PCR( realtime fluorescence quantitative PCR, RTFQ PC R)技术，该技术在P C R反应体系中加人荧光
基团，通过荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，最
后利用标准曲线对未知模板进行定性或定量分析:1]。
因其准确、快速、灵敏等特点被认为是病原微生物实验
室确证的有效手段之一。近年来该技术在流感、非典
型肺炎、埃博拉、寨卡、登革热、新型冠状病毒等新突发
传染病的确证及代谢酶、肿瘤基因检测中发挥重要作
用。荧光探针法仅检测目标扩增产物，特异性强，
因此，是目前核酸检测最常用的方法。其依赖荧光共
振能量迁移实现核酸检测，探针是该方法的关键影响
因素[I°U]。目前，探针主要包括TaqMan探针、复合探
针、分子信标探针、蝎型探针等，其中，应用最广泛的为TaqMan探针[m5] ^但是，该类探针为单链，若核酸检
测所用探针较长，则其荧光与淬灭基团间距离较远，能
收稿日期:20204)8-15 修回日期:2020~08-20
*国家科技重大专项（2018ZX10711001~003~003)、国家自然科学
基金重点项目（81830101 )资助项目
**并列第一作者
***通讯作者，：sqwang@bmi. ac. cn
乙肝病毒 CYP2C19*2
量转移效率低，淬灭不彻底，背景信号较高，可能影响 灵敏度[16_17]。本文旨在设计一种双链探针，由两条不 完全互补双链探针组成，一条链5'端标记荧光基团，3' 端标记相应淬灭基团，其互补链5'端标记荧光基团，3' 端标记相应淬灭基团。探针的主要优点：一是荧光基团和淬灭基团距离更近，淬灭更彻底，降低背景荧光信 号，可提高灵敏度；二是标记荧光和相应淬灭基团的两 条探针均与模板结合，也可进行点突变检测。
采用双链探针检测HBV S基因和代谢酶CyP2C7f2基因，验证其特异性与灵敏度。实验结果 表明，该结构用于H B V实时荧光定量PC R检测，检测 C t值小于TaqMan探针，检测效果优于（/>< 0. 05 )；用于 点突变基因分型检测，检测结果与Sanger测序结果一致。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样本中国食品药品检定研究院的乙型肝炎病毒核酸国家标准品；地坛医院体检剩余血液样本36 例以及肝炎血液样本24例。临床样本使用DNA提取 使用 QIAmp DNA Mini Kit和（Qiagen，Hilden，德国）试
2020,40(11)
刘丽艳等：双链探针实时荧光P C K 核酸检测新技术研究
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剂盒，按照说明书操作。
1.1.2引物与探针 HBV 的S 基因（NC _003977.2) 和 CYP 2C 19‘2 (681 G >A ，rs 4244285)代谢酶基因的 扩增区域参考之前文献报道，引物、探针位于扩增区域 的保守区[18'2°]。以上引物、探针由生工生物工程（上 海）股份有限公司合成并纯化。1.2方法
1.2.1 HBV  S 基因实时荧光PCR 检测
(1)
双链探针反应体系。宝生物工程（大连）有限
公司 TaKaRa  Ex  Taq ® Hot  Start  Version  核酸检测试剂： 10 x  Ex  Taq  Buffer  缓冲液 4. Ojjil , dNTPs  0.2mmol /L ，
TaKaKa  Ex  Taq  H S 聚合酶2. 5U ；上下游引物各2.4(j l I
(10|^。1/[)，双链探针1.1|^(1(^111〇1/[)，样本模板 30|x 丨，总反应体积为40|J ；反应条件J O U m i n M t ， 51^;94丈、丨5s ，55t 、30s ，共45个循环，退火时采集突 光；实时荧光PC R 反应：上海宏石SLAN  96实时荧光
PCK  仪。
(2)
TaqMa n 探针反应体系。宝生物工程（大连）有
限公司 TaKaMa  Ex  Taq ® Hot  Start  Version  核酸检测试 剂：10 x  Ex  Taq  Buffer  缓冲液 4. 0(jil ，dNTPs  0. 2mmol /L ，
TaKaRa  Ex  Taq  US 聚合酶2. 5U ；上下游引物各2. 4+1
(10jimol /L )，TaqMan  探针 1. ljjLl (l (Vmol /L )，样本模 板3<V 1，总反应体积为40|J ；反应条件：50T
，2min ;
95<€，51^11;94尤、158,55|：€；、3〇8，共45个循环，退火时 采集荧光。实时荧光PCR 反应：上海宏石SLAN  96实 时荧光PCR 仪。
1.2.2 CYP2C19*2 (681 G >A )基因型实时荧光 PCR 检测珠海宝锐生物科技有限公司Superstart Premix plus( Probe q P C R )核酸检测试剂:2 X Superstart Premix plus PCR Buffer 缓冲液丨2.5^
上下游引物各1. 2…
(HVmol /L )，双链寡核苷酸探针 0.6|x l (l 〇nni 〇l /L ) _A 模板3札总反应体积为25(xl；反应条件:5(n ：,
、2〇5,601、45s ，共 40 个循环，退
火时采集荧光。实时荧光PC R 反应：上海宏石SLAN 96实时荧光PCR 仪。
1.2.3 CY reCW Z  (681 G >A )基因型 Sanger  基因测序核酸检测结果阴性
临床CYP 2C 19‘2 DNA 样本基因型使用Applied
Biosystems  公司 Big-Dye  Terminator  V 3. 1 cycle sequencing  k it 试剂盒，测序反应体系:5 x  Buffer 缓冲液
I . (V 丨，BigDye 3. 1 酶 0.
，引物终浓度 2. 3pmol /L ，样
本 10ng ，补水至 IO j j l I ，ABI  Prism  3730x 1 Genetic  Analyzer 测序仪检测。
2结果与讨论
2.1双链探针结构设计
依赖FRET 实现实时荧光检测的TaqMan 探针，其 荧光本底信号强度受荧光基团与淬灭基团之间的距离 影响。若探针较长二者相互淬灭不彻底，本底信号高, 可能影响样本扩增曲线，从而影响结果判读[13]。设计 一种双链探针，遵循双链探针Tm 值低于探针与模板结
合T m 值的原则，由不完全互补的正、负两条链组成3 根据检测需求，两条链5'端可标记相同荧光基团或者 不同荧光基团，3'端标记对应淬灭基团。标记相同基团 可用于实时荧光PCK 定量或定性检测，标记不同基团 可用于基因分型鉴定。该结构探针一条链5'端标记的 淬光基团和另一条链3'端标记的淬灭基
团可以相互淬 灭，淬灭更完全，荧光本底较低。同时，参考中国发明 专利“一种双链寡核苷酸核酸探针的结构和用途”设计 双链探针121结构示意图见图1。
IIIIIIIIIIIIIII III II II III I
®
Q
图1
双链探针结构示意图
Fig. 1 Structure of double-stranded probe
2.2双链探针荧光本底检测
以HBV 的S 基因定量检测为目的，参考文献报道 的
定
量
核
酸
检
测
探
针
序
列
为
5'-
CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCAT -3, 16，本研究建
立的双链探针，正链序列为
5'-
CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCAT -3,，负链序歹丨J  为
5，-GCATAGCAGCAGGATGM -3，〇按照以下方式进行荧 光本底信号检测：HBV 的S 基因定量检测体系同上，以
ddH 20为模板，扩增35个循环，检测双链探针与 TaqMan 探针荧光本底信号。检测结果如图2所示，双
链探针荧光本底信号值均约925RFU ，TaqMan 探针荧 光本底信号值均在4 000 ~ 5 2〇ORFU , TaqMan 探针荧 光本底信号值是双链探针的4倍以上。实验结果表 明：双链探针淬灭效果好，荧光本底信号低。2.3 H B V 临床样本定量检测
使用以上建立的双链探针，引物、探针序列见表1 , 检测已根据国家标准品定值的HBV  1)N A 阳性血清24 份。同时使用TaqMan 探针对其进行检测，
检测反应体
30中国生物工程杂志China Biotechnology Vol. 40 No. 11 2020
12 438.1
10 999.0
9 560.0
8 120.9
循环数
图2双链探针与TaqMan探针荧光本底信号值检测结果图
Fig. 2 Detection values of the fluorescent background using double-stranded probe and TaqMan probe
The u 1 M group straight line shows the detection value of the fluorescent background signal of the TaqMan probe. The “2” group straight line shows the detection value of the fluorescent background signal of the double-stranded probe
系同。实验结果如表2所示，各浓度范围内，双链探针 值样本）。结果表明，双链探针检测灵敏度优于均能有效检出，且检测结果C t值大小优于TaqMan探 TaqMan探针，可有效检测H B V临床样本。
针，两者具有显著性差异（P< 〇.〇5，忽略未检测出Ct
表1 HBV、C Y P2C191引物及探针序列
Table 1 Primer and probe sequences of HBV, and CYP2C19 *2
名称序列(5'-3')5'荧光标记3'荧光标记
HBV-F GYTATCGCTGGATGTGTCTGC
HBV-R GACAAACGGGCAACATACCTT
HBV-P CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTCAT FAM BHQ1
GCATAGCAGCAGGATGM FAM BHQ1 CYP2C19*2-F ATTATTGTTTTCTCTTAGATAT
CYP2C19*2-R AAGTCCCGAGGGTTGTTGAT
CYP2C19*2-P TATTTCCCAGGAACCCA FAM BHQ1
TATGGGTTCCCGGGAAATAAT HEX BHQ1
临床疾病诊断、生物安全威胁、新突发传染病疫情 等领域中，病原体的鉴定尤为重要。特别是在传染病疫情中，“早发现，早诊断，早隔离，早”是传染病疫 情防控的有效手段[22]。病原检测和确证是疫情控制首 要环节，可阻断传播、避免恐慌[23〜。
实时荧光PCR技术因准确、灵敏、快速等特点被认 为是病原体微生物实验室确认的最佳方法。虽然，检 测结果受多种因素影响，如病程发展、样本采集时间与 部位、样本保存与运输以及核酸提取[25]。但是，核酸检测试剂的灵敏度仍是影响核酸检测结果的最重要因素 之一，在排除外部因素干扰下，尽量提高检测试剂的特 异性和灵敏度是有效避免假阴性结果的有效手段之一[26]。本研究建立的双链探针检测技术，通过对探针 结构的优化，探针本身荧光淬灭更彻底，荧光本底低，对实时荧光PCR扩增曲线影响小，更适用于低浓度样 本核酸检测，有助于提高病原体核酸检测灵敏度，降低
漏检率。
2020,40(11)刘丽艳等：双链探针实时荧光P C K核酸检测新技术研究31
表2双链探针与TaqM an探针检测24份
定量H B V样本C t值结果
Table 2 The Ct values of 24 quantitative HBV samples by double-stranded probe and TaqMan
probes detection
样本浓度（IU/m l)
a值
双链探针TaqMan探针
2.66x1081
3.3916.60
2.45 x1081
3.5216.62
1.93 x10813.9016.55
1.33 x10718.0821.92
1.08 x10718.342
2. 10
1.03 x10718.552
2.29
1.49 x1062
2.0025.74
1.45 x1062
2.2026. 19
1.04 x lO621.5725.36
2. 10 x 10524.5828.28
1.97 x10524.6828.33
1.35 x10525.2729. 13
1.13 x10429. 163
2.96
1.02 x lO429.323
2.72
1.01 x lO429.353
2.88
1.12x l033
2.8836.54
1.09 x10333.7137.07
1.05 x10334.0537.84
9.81 x10136.71No Ct
8.58x10'37.00No Ct
7.10x10*38.03No Ct
1.81 x10'38.89No Ct
1.12 x10'39.32No Ct
1.17x10'39.37No Ct
No Ct ：No obvious amplification curve
2.4 CYP2C19’2代谢酶基因型检测
C Y P2C W2等位基因纯合子被认为是奥美拉唑代 谢不良者，因此基因位点的检测可指导用药:7;。为了实 现个体化的合理用药，目前多采用Sanger测序、基 因芯片和实时荧光P C R等方法对C Y P2C1V2的基因 型进行检测271。其中，Sanger测序和基因芯片检测方法操作较烦琐且耗时长；实时荧光P C R检测C Y P2C191基因型需要同时使用2个P C R反应管完 成，成本较高。
针对C Y P2C191(681 G>A)单核甘酸多态性位点的基因型检测，本研究设计的双链探针的两条链均可与模板结合，同时修饰不同种类荧光基团，可在同一 个PCR扩增反应管内完成杂合型G/A、野生型G/G、突 变型A/A点突变检测。该检测过程操作简单、耗时短。
36例血液样本,Sanger测序确定代谢酶CYP2C19’ 2 基因681 G>A位点基因型，其中突变型T2厂2) A/A、野生型（‘1，1)G/G、杂合型（*1广2)G/A各12 例。使用建立的双链探针进行基因型检测，检测结果 如表3和图3所示。实验结果表明：检测野生型样本，仅探针野生链荧光信号强度均随循环数增加而增加；检测突变型样本，仅探针突变链荧光信号强度均随循环数增加而增加；检测杂合型样本，探针野生链与突变 链荧光信号强度均随循环数增加而增加。结果表明，本文建立的多标记双链探针可进行基因点突变检测，检测结果与Sanger测序结果完全一致，可有效区分CYP2C W 2基因型。
表3双链探针检测3种CYP2C1V 2基因型样本结果Table 3 Detection results of three kinds of CYP2C19 *
2 genotypes by double-stranded probe
编号
C t值
野生链突变链
G/A G/G A/A G/A G/G A/A 132.4431.90No Ct30. 66No Ct29.49
234.3132.45No Ct32.59No Ct32.53
332.6636.97No Ct30.65No Ct36. 32
437.6630.77No Ct36. 08No Ct31. 11
534.0732. 10No Ct32.94No Ct24.50
629. 1436.04No Ct28.45No Ct32.80
729.0935. 12No Ct27.61No Ct28.68
831.7837. 14No Ct30. 29No Ct28.83
928.4828.64No Ct26.95No Ct29.97
1031.4632.21No Ct29.74No Ct30.01
1136.6032.33No Ct34.92No Ct31. 19
1232.2733.63No Ct31.50No Ct31.23
No Ct ：No obvious amplification curve
3结论
研究建立的双链探针其正/负链5'端均可标记荧光基团，3'端均可标记淬灭基团，双链探针彼此互相淬灭，降低荧光信号本底值，减少本底信号对实时荧光定 量曲线的影响，提高样本检测的灵敏度，可用于传染病
32中国生物工程杂志China Biotechnology Vol. 40 No. 11 2020
1.30992
1.11489
0.91986
0.724 83
c2 0.52979
0.33476
0.13973
-0.055 30
-0.25033
-0.445 36
(a)(b)(c)
图3双链探针检测36份不同CYP2C19 ‘2基因型样本结果图
Fig. 3 The detection of 36 samples of different CYP2C19" 2 genotypes by double-stranded probe
(a) 12 samples of mutation genotype (A/A) by double-stranded probe detection (b) 12 samples of wild genotype (G/G) by double-stranded probe detection ( c) 12 samples of heterozygous genotype( G/A) by double-stranded probe detection
相关病原微生物诊断检测如乙肝、埃博拉、非洲猪瘟病 毒。进行不同浓度HBV定量检测时，建立的双链探针 核酸检测C t值小于TaqMan探针，具有显著性差异（P <〇.〇5)。此外，双链探针结构的两条链5'端可以标记 不同荧光基团，且均可以与模板结合。因此，可以用于 点突变基因分型检测，可实现代谢酶CYP2C19# 2基因 准确分型，检测结果与Sanger测序完全一致。特异性 与灵敏度是核酸检测技术最关心的两个指标，本研究 建立的双链探针可以在保证特异性的前提下，提高检 测灵敏度，也可用于基因型检测。该技术有望更广泛的用于定量、定性、基因分型、肿瘤基因点突变检测等领域。
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