[19]
中华人民共和国国家知识产权局
[12]发明专利申请公布说明书
[11]公开号CN 101109018A [43]公开日2008年1月23日
[21]申请号200710041726.X [22]申请日2007.06.07
[21]申请号200710041726.X
[71]申请人上海交通大学
地址200240上海市闵行区东川路800号
[72]发明人贺林 秦胜营 唐吉敏 沈陆 [74]专利代理机构上海交达专利事务所代理人毛翠莹[51]Int.CI.C12Q 1/68 (2006.01)C12Q 1/25 (2006.01)C12N 15/11 (2006.01)
G01N 33/02 (2006.01)
C07H 21/00 (2006.01)
权利要求书 1 页 说明书 9 页
[54]发明名称
CYP2D6基因第九号外显子的单核苷酸多态性的检
测方法
[57]摘要
本发明涉及一种CYP2D6基因第九号外显子的单
核苷酸多态性的检测方法，同时涉及一种分离核酸、
一种等位基因特异性的核酸引物。方法包括：确定
在人CYP2D6基因第九号外显子的SEQ ID NO：1所示
核酸结果查询
序列的第1322位的核苷酸；检测在所述位置是否存
在单核苷酸多态性；一种分离核酸，具有SEQ ID N
O ：1所示的序列，且第1322位为A；一种等位基因
特异性的核酸引物，其长度为15－50bp，且特异性
地杂交并扩增出含人CYP2D6基因的第九号外显子的
SEQ IDNO：1所示序列的第1322位的单核苷酸多态
性的扩增产物。本发明可用于研究我国人中CYP2
D6基因多态性与临床用药安全的关系，为新药研发
提供指导依据。
200710041726.X权 利 要 求 书第1/1页    1.一种CYP2D6基因第九号外显子的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于包括如下步骤：
(a)采用Primer 5.0软件，以GenBank数据库CYP2D6基因第九号外显子以及外显子与内含子接合部位序列为模板设计一对等位基因特异性的核酸引物，利用引物对来扩增CYP2D6基因的第九号外显子的DNA序列，对扩增产物进行分离纯化，得到相应分离核酸；
(b)检测分离核酸的CYP2D6基因第九号外显子的SEQ ID NO：1所示序列的第1322位核苷酸是否存在单核苷酸多态性，即G→A多态性。
2.根据权利要求1的CYP2D6基因第九号外显子的单核苷酸多态性的检测方法，其特征在于步骤(b)检测多态性时采用的方法包括：DNA测序法、杂交测序法；酶促错配切割法、异源双链分析法、点杂交法、寡核苷酸阵列法、微测序法、Taqman技术、分子信标法，变性高效液相谱法。
3.权利要求1的检测方法的应用，其特征在于用于评估个体患CYP2D6基因的第九号外显子相关疾病的易感性，用于研究我国人中CYP2D6基因多态性与临床用药安全的关系，用于新药的研究开发。
4.一种分离核酸，其特征在于，它具有SEQ ID NO：1所示的序列，且第1322位为A。
5.一种等位基因特异性的核酸引物，其特征在于，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并扩增出含人CYP2D6基因的第九号外显子的SEQ ID NO：1所示序列的第1322位的单核苷酸多态性的扩增产物。
200710041726.X说 明 书第1/9页CYP2D6基因第九号外显子的单核苷酸多态性的检测方法
技术领域
本发明涉及的是基因技术领域的核酸及其引物和检测方法，具体地讲是一种分离核酸、一种等位基因特异性的核酸引物和CYP2D6基因第九号外显子的单核苷酸多态性的检测方法。
背景技术
细胞素氧化酶P450 2D6(CYP2D6)也称之为异喹胍羟化酶，是细胞素P450的一个成员。C Y P2D是第一个被发现存在遗传多态性的细胞素氧化酶P450，目前哺乳动物体内至少发现了21种CYP2D。而人类的CYP2D位于22q13.1，由CYP2D6、CYP2D7P和CYP2D8P共同构成，其中CYP2D7P和CYP2D8P为假基因，仅CYP2D6有功能蛋白表达。CYP2D6主要在肝脏中表达，CYP2D6共有497个氨基酸组成。CYP2D6不仅氧化代谢某些内源性的类固醇激素，而且还是20-25％常用药物的主要代谢酶。CYP2D6的底物包括β受体阻断剂普萘洛尔(Propranolol)等、抗心率失常药奎尼丁(Quinidine)、普罗帕酮(Propafenone)等，降压药异喹胍(D e b r i s o q u i n e)等，镇痛药曲马多(T r a m a d o l)，抗精神病药奋乃静(Perphenazine)、氟哌丁醇(Haloperidol)等，止咳平喘药可待因(Codeine)、右美沙芬(Dextromethorphan)等，降血糖药苯乙双胍(Phenformine)等，5-HT 拮抗剂托烷司琼(Tropisetron)等，三环类抗抑郁药，抗心绞痛药等。CYP2D6的活性受到遗传因素及环境因素的影响，但遗传因素是最主要的原因。多数CYP2D6的单核苷酸突变可以影响基因的后续转录和表达，进而改变了酶的结构和活性，
这是造成个体差异的主要原因。鉴于CYP2D6在药物代谢中的作用及活性存在个体差异，因此对解决CYP2D6基因多态性的检测和相关问题是现有技术急需解决的技术难题。
对现有文献的检索，未发现有本发明的CYP2D6基因第九号外显子(G4046A) SNP(单核苷酸多态性)相关的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种CYP2D6基因第九号外显子的单核苷酸多态性的检测方法，同时涉及一种分离核酸、一种等位基因特异性的核酸引物，可用于评估个体患CYP2D6基因的第九号外显子相关疾病的易感性，以及用于C Y P2D6基因多态性与临床用药安全关系的研究。    本发明是通过以下技术方案实现的，第一方面，提供了一种检测人CYP2D6基因第九号外显子的单核苷酸多态性的方法，它包括步骤：
(a)采用P r i m e r 5.0等相关软件，以G e n B a n k数据库C Y P2D6基因(AY545216)第九号外显子以及外显子与内含子接合部位序列为模板设计一对等位基因特异性的核酸引物，利用引物对来扩增CYP2D6基因的第九号外显子的DNA序列，对扩增产物进行分离纯化，得到相应分离核酸。
(b)检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性。采用一些分析技术可用于检测分离核酸的CYP2D6基因第九号外显子的SEQ ID NO：1所示序列的第1322位核苷酸是否存在单核苷酸多态性，即G→A多态性。
这些分析技术包括(但并不限于)：DNA测序法、杂交测序法；酶促错配切割法、异源双链分析法、点杂交法、寡核苷酸阵列法、微测序法、Taqman技术、分子信标法，变性高效液相谱法。
在本发明的第二方面，提供了一种分离核酸，它具有SEQ ID NO：1所示的序列，且第1322位为A。
在本发明的第三方面，提供了一种等位基因特异性的核酸引物，其长度为15-50bp，且特异性地杂交并扩增出含人CYP2D6基因第九号外显子的SEQ ID NO：1所示序列的第1322位的单核苷酸多态性的扩增产物。
本发明所述的“分离纯化”是指在基因组DNA水平上，利用引物对来扩增每个多态性位点的基因序列和利用纯化试剂盒对扩增产物进行提纯。    用于本发明的测试样品没有特别限制，对于检测SNP而言，可以是从血液、组织等样品中抽提出的DNA或mRNA。对于CYP2D6基因的第九号外显子活性而言，可以任何含有CYP2D6基因的第九号外显子的样品，如血液等。
本发明的实质性特点和显著进步表现在：是一项原创性的发明。本发明的内容涉及一种分离出的或纯化的CYP2D6基因的第九号外显子多态性位点的基因序列，所说的“分离出的或纯化的”是指在基因组DNA水平上，利用引物对来扩增多态性位点的基因序列和利用纯化试剂盒对扩增产物进行提纯。通过对所取样品C Y P2D6基因测序结果，在上海中发现了1个样品含有C Y P2D6基因的第九号外显子S N P(即第1322位G→A多态性)，频率为0.003。经分析发现，该SNP导致第441位氨基酸由Arg(R)→His(H)。由于
这是不同性质氨基酸的置换，因此，会导致CYP2D6基因的第九号外显子所编码的蛋白活性发生改变，从而引起酶活性发生改变，进一步影响CYP2D6酶代谢的药物。
本发明为研究我国人中C Y P2D6基因多态性与临床用药安全的关系奠定了基础，为药物设计和临床用药个体化提供了基因学理论根据，同时也为基于药物基因组学理念的新药研发提供指导依据，具有重大的理论意义和潜在的实用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
步骤1
一种核酸的分离和测序
引物设计：
采用P r i m e r 5.0软件，以G e n B a n k数据库C Y P2D6基因(A Y545216)第九号外显子以及外显子与内含子接合部位序列为模板设计一对等位基因特异性的核酸引物，由Invitrogen公司合成。
引物信息：
扩增C Y P2D6基因的第九号外显子S N P位点的D N A序列引物信息：

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