实时荧光定量PCR检验乙肝DNA的检测结果的分析
【摘要】目的 利用实时荧光定量PCR针对乙肝DNA开展检测，分析为检测结果产生影响的各方面因素。  方法 此次研究针对300例病例，且全部确诊为乙型肝炎病毒感染，收治开始和结束时间分别为2021年3月、2022年2月，对患者血液标本开展采集，利用实时荧光定量PCR对其进行检测，分析检测结果。  结果300例标本中，实时荧光定量PCR诊断乙肝DNA准确260例，占比86.67%；漏诊误诊40例，占比13.33%。实时荧光定量PCR诊断准确率和临床诊断无较大差异（P＜0.05）。  结论在针对乙肝DNA进行检测的过程中，使用实时荧光定量PCR可以产生较高的价值，但是可能会出现误诊等情况，所以需要进行综合预防。
【关键词】实时荧光定量PCR；乙肝DNA
[Abstract] objective to detect hepatitis B DNA by real-time fluorescent quantitative PCR and analyze the factors influencing the detection results. Methods in this study, 300 cases were diagnosed as hepatitis B virus infection. The start and end time of admission were March 2021 and February 2022 respectively. Blood samples were collected, detected by real-time fluorescence quantitative PCR, and the detection results were analyzed. Results among the
300 samples, 260 cases (86.67%) of hepatitis B DNA were diagnosed accurately by real-time fluorescent quantitative PCR; 40 cases were missed and misdiagnosed, accounting for 13.33%. There was no significant difference between the diagnostic accuracy of real-time fluorescence quantitative PCR and clinical diagnosis (P < 0.05). Conclusion in the process of detecting hepatitis B DNA, real-time fluorescent quantitative PCR can produce high value, but it may be misdiagnosed, so comprehensive prevention is needed.
[Key words] real time fluorescence quantitative PCR; Hepatitis B DNA
乙型肝炎病毒是诱发慢性肝炎等一些疾病的主要病毒，属于一种嗜肝病毒科。实时荧光定量PCR针对乙肝DNA开展检测，是临床公认的一种具有良好效果的方法【1】。这种检测方法可以有效提高诊断的准确率。此次研究分析利用实时荧光定量PCR针对乙肝DNA开展检测的结果 ，具体报道如下：
1 资料和方法
1.1一般资料
此次研究针对300例病例，且全部确诊为乙型肝炎病毒感染，收治开始和结束时间分别为2021年3月、2022年2月，女、男比例为160:140，年龄为12至60岁之间，均值为（43.54±3.54）岁。对患者血液标本开展采集，利用实时荧光定量PCR对其进行检测。患者一般资料无明显差异（P＞0.05）。
1.2方法
在对患者开展诊断前，需要抽取患者空腹静脉血，将其静脉血放入到干燥试管中，且试管中包括EDTA-K2抗凝管，利用高速离心开展操作，离心时间控制为五分钟，选择新鲜的标本开展检查，利用实时荧光定量PCR针对乙肝DNA开展检测。
标本需要在94摄氏度下开展预变，时间为两分钟，后续开展40个90到55摄氏度循环。在结束反应后，开展标准曲线制作工作，针对标本中包括的DNA模板量开展计算工作，后续按照试剂盒中的阳性质控标准进行分析，确定标本定量阳性质控，开展核酸扩增工作。
1.3观察指标
针对实时荧光定量PCR检测乙肝DNA的准确率进行对比，其中，荧光定量PCR阴性标准为不
超过1×103拷贝数/ml，实时荧光定量PCR阳性标准为超过1×103拷贝量/ml，根据临床综合诊断进行分析，且研究出现各种差异的原因。
1.4统计学分析
录入SPSS18.0统软件中处理。
2 结果
300例标本中，实时荧光定量PCR诊断乙肝DNA准确260例，占比86.67%；漏诊误诊40例，占比13.33%。实时荧光定量PCR诊断准确率和临床诊断无较大差异（P＜0.05），见表1。
表1：分析漏诊误诊原因[n(%)]
原因
例数
比例
实验室条件
9
22.50
标本抗凝血
10
25.00
标本储存
10
核酸结果查询平台
25.00
溶血以及血脂影响
7
17.50
核酸提取方法
4
10.00
3、讨论
利用实时荧光定量PCR在针对乙肝DNA开展检测的过程中，影响因素相对比较多，通过此次研究发现，主要影响因素标包括标本影响、实验室影响等，其中影响发生例数较多的为标本影响，标本影响中包含抗凝血产生的影响，标本储存方面存在的影响等【2-3】。标本抗凝血影响主要是因为实时荧光定量PCR借助血浆以及血清全部可以进行检查。但是，在利用肝素抗凝剂的过程中可能会出现裂解失效情况，以致于检查结果存在差异。在针对标本进行储存的过程中，室温储存以及冰冻储存通常不会为检查结果带来较大的影响。但是，若是室内温度较高，例如温度大于25摄氏度，储存三小时，可能会导致检查发生异常情况。溶血和血脂，会使血红蛋白出现变形情况，对Taq酶活性产生一定的抑制效果，导致荧光猝灭，荧光信号强度下降等，最终影响诊断结果【4】。实验室方面也会影响诊断准确率，实验室检查中微量感染会使假阳性情况出现，在提取核酸的过程中，使用的提取方法存在差异也会为检查结果带来较大的影响。各种提取方法中，煮沸裂解法提取效果相对比较差，而磁珠核酸提取方法产生的效果相对比较理想。所以，临床工作者指出利用煮沸裂解法无法对血清标本进行有效处理，可以积极利用浓缩裂解方法【5】。
通过分析这些原因，实验室在开展实时荧光定量PCR的过程中需要注意下述几个方面内容。首先，需要针对实验室条件进行规范，严格按照分区使用原则进行操作，防止随意跨区域搬动物品，并且需要在使用离心机等仪器时，严格按照说明书进行使用，实验室检工作者不能随意走动，且需要在实验室中安装相应的通风设备，且重视排除空气可能会导致检查结果出现异常的各种物质。在标本中需要选择合适的试剂盒。在储存的过程中，需要运用专门的冰箱分开放置拆封和未拆封的试剂，且标注好实际有效期、开封时间等信息，避免出现标本采集污染情况，防止混入污染物【6】。在处理标本的过程中，确保每人一个吸头，且利用带滤芯吸头，避免气溶胶出现污染情况，防止标本被长时间污染。另外，实验室工作人员需要积极接受培训，确保自身的检查能力不断提高，优化整体检查结果，且需要全面细致消毒以及保养仪器和相关用具，定期对仪器和用具进行校准。
总之，在利用实时荧光定量PCR针对乙肝DNA开展检测的过程中，需要分析各种影响检测结果准确率的因素，采取有效的预防措施，提高检测的准确率。
【参考文献】
  [1]杨秀丽，李振勤，刘晓荣，等.实时荧光定量PCR法检测乙肝病毒DNA的价值分析与研究
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[2]陈艳.实时荧光PCR检验用于乙肝病毒DNA检测的临床价值[J].临床研究，2018，26（10）：146-148.
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[4]魏颖.实时荧光定量PCR对乙肝DNA检测的影响因素.求医问药(下半月),2012(12): 373.
  [5]王铁兵等.深圳市隐匿性乙型肝炎病毒感染现状和感染因素分析. 中国公共卫生管理, 2013(01): 58-60.
  [6]蔡春林等.2009年深圳市外来劳务工血清乙肝标志物与HBV-DNA的检测分析. 实用预防医学, 2011(01): 47-49.

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