(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011463358.X
(22)申请日 2020.12.14
(71)申请人 臻和（北京）生物科技有限公司
地址 100191 北京市海淀区花园北路35号
健康智谷大厦9层903
申请人 臻和精准医学检验实验室无锡有限
公司
(72)发明人 李坤　魏继雨　陈豫　
(74)专利代理机构 常州佰业腾飞专利代理事务
所(普通合伙) 32231
代理人 张红艳
(51)Int.Cl.
C12Q  1/689(2018.01)
C12Q  1/6851(2018.01)
(54)发明名称
一种用于生物组织样本检测细菌污染的质
检方法
(57)摘要
本发明属于生物工程质检技术领域，具体涉
及一种用于生物组织样本检测细菌污染的质检
方法，分别配制两种RT ‑qPCR反应体系，分别扩增
细菌16S的rRNA和人ACTB，经过RT ‑qPCR反应后，
根据扩增后的细菌16S的rRNA的CT值和人ACTB的
CT值的差值ΔCT=CT (ACTB)‑CT (16S)，比较ΔCT与阈
值的关系：若高于阈值，则生物组织样本为阳性，
质控不合格；若低于阈值，则生物组织样本为阴
性，质控合格。本发明方法在阈值取4时，质控结
果具有最佳的灵敏度（86.7%）和特异性（93.8%），
且检测方便、耗时短、
准确度高。
权利要求书1页  说明书5页序列表2页  附图2页CN 112226528 A 2021.01.15
C N  112226528
A
1.一种用于生物组织样本检测细菌污染的质检方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）分别配制两种RT -qPCR反应体系，分别用于扩增细菌16S  rRNA和人ACTB：
向扩增细菌16S  rRNA反应体系中加入正向引物SEQ  ID  NO.1、反向引物SEQ  ID  NO.2和生物组织样本RNA模板，进行RT -qPCR扩增反应；
向扩增人ACTB反应体系中加入正向引物SEQ  ID  NO.3、反向引物SEQ  ID  NO.4和生物组织样本RNA模板，进行RT -qPCR扩增反应；
（2）分析步骤（1）扩增后的细菌16S  rRNA的CT值和人ACTB的CT值，若细菌16S  rRNA的CT 值和人ACTB的CT值均＞30，则直接判定生物组织样本质控不合格；
若细菌16S  rRNA的CT值或人ACTB的CT值≤30，则对两者的CT值求差值ΔCT=CT (ACTB)-CT (16S)；
所述CT (16S)为细菌16S  rRNA扩增的CT值，表示细菌16S  rRNA的表达含量，所述CT (ACTB)为人ACTB扩增的CT值，表示人ACTB的表达含量；
（3）比较ΔCT与阈值的关系：若高于阈值，则待测样本为阳性，判定质控不合格；若低于阈值，则待测样本为阴性，判定质控合格。
2.根据权利要求1所述的用于生物组织样本检测细菌污染的质检方法，其特征在于，所述正向引物SEQ  ID  NO.1和所述反向引物SEQ  ID  NO.2用于扩增细菌16S  rRNA保守区序列，所述细菌16S  rRNA保守区序列为SEQ  ID  NO.5。
3.根据权利要求1所述的用于生物组织样本检测细菌污染的质检方法，其特征在于，所述正向引物SEQ  ID  NO.3和所述反向引物SEQ  ID  NO.4用于扩增人ACTB保守区序列，所述人ACTB保守区序列为SEQ  ID  NO.6。
4.根据权利要求1所述的用于生物组织样本检测细菌污染的质检方法，其特征在于，所述正向引物SEQ  ID  NO.1、反向引物SEQ  ID  NO.2、正向引物SEQ  ID  NO.3和反向引物SEQ  ID  NO.4为硫代修饰后的引物。
5.根据权利要求1所述的用于生物组织样本检测细菌污染的质检方法，其特征在于，所述生物组织样本为
福尔马林固定的石蜡包埋的生物组织样本；步骤（1）中所述生物组织样本RNA模板为生物组织样本提取的RNA。
6.根据权利要求1所述的用于生物组织样本检测细菌污染的质检方法，步骤（1）中所述RT -qPCR扩增反应的条件为：第一阶段为逆转录阶段，50℃ 10min；第二阶段为预变性阶段，95℃ 5min；第三阶段为PCR反应阶段，95℃ 10s，60℃ 30s；第四阶段扩增产物熔解阶段，95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s，60℃ 15s。
7.根据权利要求1所述的用于生物组织样本检测细菌污染的质检方法，其特征在于，步骤（3）中所述阈值的确定方法为，将高于某一ΔCT的检测结果判定为阳性，低于该ΔCT的检测结果判定为阴性，将该ΔCT作为阈值。
8.根据权利要求1所述的用于生物组织样本检测细菌污染的质检方法，其特征在于，所述阈值为4。
权　利　要　求　书1/1页CN 112226528 A
一种用于生物组织样本检测细菌污染的质检方法
技术领域
[0001]本发明属于生物工程质检技术领域，具体涉及一种用于生物组织样本检测细菌污染的质检方法。
背景技术
[0002]随着生物技术的发展，临床选择更广泛，除了传统的放射、化学药物和手术，近年来靶向药物和免疫取得了巨大的进步，而靶向和免疫的针对性很强，每种药物都有特异的作用位点，患者只有携带特定的变异位点才能选择相应的药物进行，这就要求患者在选择药物前需要进行基因检测才能更好地进行用药。[0003]临床用药指导进行基因检测中很多项目只检测DNA，但是DNA并不完全包含药物靶点，比如基因融合、基因结构变异和基因表达水平等并不能通过DNA序列得到，而RNA是重要的遗传物质，基因中编码的信息被转录成RNA分子，而RNA分子又可以翻译成蛋白质或直接用于精细控制基因表达。因此，以一定条件和时间转录的RNA反映了细胞的当前状态，并可以揭示疾病的病理机制，而且RNA在科研活动中也有着广泛的应用。
[0004]临床上进行检测的样本来源主要是福尔马林固定的石蜡包埋（Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded，FFPE）的组织样本，因此，进行用药指导的基因检测必须首先从FFPE样本中提取RNA，然后进行RNA测序得到需要的基因信息，所以，FFPE的质量决定了最终能够得到的信息的准确性。
[0005]细菌体积小、形状多样、种类繁多、繁殖快、生命力顽强，在基础研究和临床试验中危害极大。FFPE样本在取样和保存过程中如果没有严格按照标准操作规程操作容易滋生细菌，细菌污染会导致从FFPE样本中提取的核酸不完全是人类基因还包括细菌基因，而且细菌滋生还会使FFPE中人类基因严重
降解，这都会影响得到的基因质量，进而影响检测结果的准确性。所以从FFPE样本中检测细菌污染对于RNA测序是很重要的一个质控。
[0006]目前临床应用中对于FFPE样本提取核酸是否有细菌污染并不重视，急需一种简便快捷的方法作为整个流程的质控，来避免有细菌污染的核酸进入下一环节继续实验影响最终结果的准确性。随着PCR、基因测序等技术的不断进步，细菌检测由最初的表型和化学鉴定演变成分子水平的研究。荧光定量PCR（RT-qPCR）方法因其特异性好、速度快、灵敏度高、重复性好、定量准确等优点成为分子生物学研究中的重要工具。
[0007]目前的细菌检测只扩增细菌16S rRNA保守区序列，指标单一，不能很好的反映FFPE样本中提取的RNA质量，而人的管家基因（人ACTB）高度保守而且表达水平受环境因素影响较小，可以反映人基因状态。
[0008]因此，本发明提出一种通过检测FFPE样本中提取的RNA中细菌16S rRNA和人ACTB，能够更好地体现RNA质量，有利于RNA的后续研究及应用。
发明内容
[0009]为了解决现有技术中检测FFPE组织样本中细菌方法存在的检测指标单一、检测结
果的准确度不高、特异性差、耗时长等问题，本发明在于提供一种用于生物组织样本检测细菌污染的质检方法，利用RT-qPCR反应，通过扩增细菌16S rRNA部分保守区序列和人ACTB检测细菌污染的方法，将细菌污染程度与ΔCT相关联，具有高的灵敏度和特异性、耗时短的优点。
[0010]本发明是通过如下技术方案实现的：
一种用于生物组织样本检测细菌污染的质检方法，包括如下步骤：
（1）分别配制两种RT-qPCR反应体系，分别用于扩增细菌16S rRNA和人ACTB：
向扩增细菌16S rRNA反应体系中加入正向引物SEQ ID NO.1、反向引物SEQ ID NO.2和生物组织样本RNA模板，进行RT-qPCR扩增反应；
向扩增人ACTB反应体系中加入正向引物SEQ ID NO.3、反向引物SEQ ID NO.4和生物组织样本RNA模板，进行RT-qPCR扩增反应；
（2）分析步骤（1）扩增后的细菌16S rRNA的CT值和人ACTB的CT值，若细菌16S rRNA的CT 值和人ACTB的CT值均＞30，则直接判定生物组织样本质控不合格；
若细菌16S rRNA的CT值或人ACTB的CT值≤30，则对两者的CT值求差值ΔCT=CT(ACTB)-CT(16S)；
模板图片 背景
所述CT(16S)为细菌16S rRNA扩增的CT值，表示细菌16S rRNA的表达含量，所述CT(ACTB)为人ACTB扩增的CT值，表示人ACTB的表达含量；
（3）比较ΔCT与阈值的关系：若高于阈值，则待测样本为阳性，判定质控不合格；若低于阈值，则待测样本为阴性，判定质控合格。
[0011]进一步地，所述正向引物SEQ ID NO.1和所述反向引物SEQ ID NO.2用于扩增细菌16S rRNA保守区序列，所述细菌16S rRNA保守区序列为SEQ ID NO.5。
[0012]细菌16S rRNA序列具有高度的保守性，较强的普遍性。细菌16S rRNA的特点：（1）多拷贝，检测敏感性高；（2）多信息，由可变区和保守区组成，保守区为大部分细菌所有，可根据保守区设计通用引物，利用可变区设计出细菌特异引物，作为细菌检测最理想的序列。[0013]进一步地，所述正向引物SEQ ID NO.3和所述反向引物SEQ ID NO.4用于扩增人ACTB保守区序列，所述人ACTB保守区序列为SEQ ID NO.6。
[0014]人ACTB基因是人基因组的一个管家基因，在大多数细胞中表达水平相对稳定。这也是人们常用其作为内参的原因，可以反映人类基因状态。
[0015]优选地，所述正向引物SEQ ID NO.1、反向引物SEQ ID NO.2、正向引物SEQ ID NO.3和反向引物SEQ ID NO.4为硫代修饰后的引物。
[0016]本发明所使用的上述PCR用引物进行了硫代修饰，能够特异性扩增细菌16S rRNA 保守区序列和人ACTB保守区序列，有利于更好的扩增，提高后续细菌检测判定的灵敏度和特异性。
[0017]进一步地，所述生物组织样本为福尔马林固定的石蜡包埋的生物组织样本；步骤（1）中所述生物组织样本RNA模板分别为福尔马林固定的石蜡包埋的生物组织样本提取的RNA；
进一步地，步骤（1）中所述RT-qPCR扩增反应的条件为：第一阶段为逆转录阶段，50℃ 10min；第二阶段为预变性阶段，95℃ 5min；第三阶段为PCR反应阶段，95℃ 10s，60℃ 30s；第四阶段扩增产物熔解阶段，95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s，60℃ 15s。
[0018]步骤（3）中所述阈值的确定方法为，将高于某一ΔCT的检测结果判定为阳性，低于该ΔCT的检测结果判定为阴性，将该ΔCT作为阈值。
[0019]NGS测序得到的样本提取RNA的细菌含量超过10%判定为不合格，细菌含量低于10%判定为合格，高于某一ΔCT值判定为阳性样本，低于该ΔCT值判定为阴性样本，然后，计算灵敏度和特异性，所述灵敏度=（真阳性样本数/NGS测序判定的不合格样本数）*100%，所述特异性=（真阴性样本数/NGS测序判定的合格样本数）*100%，以最佳灵敏度和特异性时的ΔCT值为阈值。其中真阳性样本数为判定为阳性样本中被NGS测序判定的不合格样本数量，真阴性样本数为判定为阴性样本中被NGS测序判定的合格样本数量。
[0020]优选地，所述阈值为4，具有较高的灵敏度（86.7%）和特异性（93.8%）。
[0021]相对于现有技术，本发明具有如下效果：
（1）本发明分别筛选能够特异性增加检测性能的细菌16S rRNA保守区序列（如SEQ ID NO.5所示）和人ACTB保守序列（如SEQ ID NO.6所示），该细菌16S rRNA保守区序列和人ACTB 保守区序列能够特异性代表细菌和人的基因。
[0022]（2）相对于现有技术中采用仅针对单一指标细菌16S rRNA检测，可能导致误判的风险，不能很真实的反应生物组织样本中提取的RNA的质量，本发明通过同步检测生物组织样本中提取的RNA中细菌16S rRNA和人ACTB，利用其扩增后的CT值求差值ΔCT（CT(ACTB)-CT(16S)）与生物组织样本中提取的RNA中细菌含量的关系，进而确定生物组织样本的RNA质量，具有较高的灵敏度（86.7%）和特异性（93.8%）。
附图说明
[0023]图1为FFPE样本提取的RNA经RT-qPCR检测过程中，人ACTB和细菌16S rRNA扩增CT 值与NGS验证的细菌含量的曲线图；
图2为通过RT-qPCR检测质控品的人ACTB和细菌16S rRNA扩增曲线；
图3为FFPE提取RNA通过RT-qPCR检测过程中，不同阈值对应的灵敏度和特异性曲线。
具体实施方式
[0024]下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0025]一、引物对及质控品的准备
（1）用于扩增细菌16S rRNA的正向引物SEQ ID NO.1：5’- CCTACGGGNGGCWGCAG -3’；反向引物SEQ ID NO.2：5’- GACTACHVGGGTATCTAATCC -3’；
（2）用于扩增人ACTB的正向引物SEQ ID NO.3：5’- CATCCGCAAAGACCTGTACG -3’；反向引物SEQ ID NO.4：5’- CCTGCTTGCTGATCCACATC -3’；
（3）细菌16S rRNA保守区序列SEQ ID NO.5：GCCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAGGGTAACG GCCTACCAAGGCAATGATGCATAGCCGAGT
TGAGAGACTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTC CTACGGGAGGCAACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGG

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