•论著•
基因多态性妊娠高血压综合征患者MTHFR基因C677T多态性与
Hey及肾功能指标的相关性研究*
何丽梅李海川仲伟国傅启华3，龚波也
上海市长宁区妇幼保健院：1.检验科2妇产科，上海200050；3.上海交通大学医学院
附属上海儿童医学中心检验科，上海200127
摘要：目的探讨妊娠高血压综合征(简称妊高征)患者5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因C677T多态性与同型半胱氨酸(Hey)、肾功能指标的相关性。方法纳入妊高征患者86例(疾病组，根据疾病严重程度，进一步分为妊娠高血压组、轻度子痫前期组、重度子痫前期组3个亚组)，同时纳入健康妊娠女性200例(正常妊娠组)和健康非妊娠女性150例(健康对照组)，采集研究对象的血液标本进行Hey、尿酸(UA)、肌肝(C『)及尿素氮(BUN)水平检测，并进行分析。此外，对86例妊高征患者的MTHFR基因进行测序，利用Chro-mas软件对测序结果跟健康人进行比对，出多态性位点进行分析。结果与健康对照组、正常妊娠组相比，疾病组Hcy、UA、Cr及BUN水平均明显升高(P<0.05)，且以上指标在重度子痫前期组明显升高(P< 0.05)。MTHFR C677T基因型与Hey具有相关性(P<0.05),Hcy在TT基因型患者中的水平高于CC基因型和C
T基因型患者(P<0.05)。结论Hey及肾功能指标可作为妊高征辅助诊断及病情监测的重要指标, MTHFR基因C677T多态性的检测可为妊高征患者病情严重程度及预后判断提供一定依据，为发现妊高征高危人提供新思路。
关键词：5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶；基因多态性；同型半胱氨酸；肾功能；妊娠高血压综合征DOI：10.3969/j.issn.1673-4130.2021.02.012中图法分类号:R714.25
文章编号：1673-4130(2021)02-0181-05文献标志码:A
Correlation between MTHFR gene C677T polymorphism with homocysteine and renal function
indicators in patients with hypertensive disorder complicating pregnancy*
HE Limei1,LI Haichuan1,ZHONG Weiguo2,FU Qihua3?GONG Bo
1.Department of Clinical Laboratory;
2.Department of Obstetrics and Gynecology,Shanghai
Changning District Maternity and Infant Health Care Hospital, Shanghai200050,China;
3.A f f iliated Shanghai Children s Medical Center,School o f Medicine,
Shanghai Jiaotong University^Shanghai200127,China
Abstract:Objective To investigate the correlation between MTHFR gene C677T polymorphism with ho­mocysteine and renal function indicators in the patients with hypertensive disorder complicating pregnancy (HDCP).Methods Eightysix cases of HDCP were enrolled(disease group,which was further divided into three subgroups：the HDCP group,mild eclampsia prophase group and severe eclampsia prophase group).At the same time,200females of healthy pregnancy(normal pregnancy group)and150healthy females of non­pregnancy(healthy control group)were included.The blood samples were collected for detecting the levels of homocysteine(Hey),uric acid(UA),creatinine(Cr)and urea nitrogen(BUN),and conducting the analysis. In addition,the MTHFR gene in the samples of86HDCP cases conducted the sequencing,then the sequencing results were compared with the healthy population by using the Chromas sequence comparison software.The polymorphic sites were found out.for conducting the analysis.Results Compared with the healthy control group and normal pregnancy group,the levels of serum Hcy,UA,Cr and BUN of the disease group were sig­nificantly increased(P<0.05),moreover the above indicators in the severe eclampsia prophase group were
*基金项目：上海市长宁区卫生和计划生育委员会课题(20164Y012)
作者简介：何丽梅，女，主管技师，主要从事肿瘤表观遗传学机制方面的研究。△通信作者,E-mail：136****8202@126。
本文引用格式：何丽梅，李海川，中伟国，等.妊娠高血压综合征患者MTHFR基因C677T多态性与Hey及肾功能指标的相关性研究
国际检验医学杂志,021,2(2)181-184.
much significantly increased(P<0.05).The MTHFR C677T genotype had the correlation with Hey(P< 0.05)andtheHcylevelintheTTgenotypepatientswashigherthanthatintheCCgenotypeandCTgeno-type patients(P<0.05).Conclusion Hey and renal function indicators can serve as the important,indicators ofauxiliarydiagnosisanddiseasecondition monitoring of HDCP,the MTHFR gene C677T polymorphism de-tectionprovidesacertainbasisforjudgingtheseverityofthepatientswith HDCPandprognosis,whichpro-videsanewideaforfindingthepopulationofHDCP.
Key words：MTHFR；gene polymorphism；homocysteine；renal function；hypertensive disorder omplicatingpregnancy
妊娠高血压综合征（简称妊高征）是妊娠期女性常见的产科疾病之一。妊高征在我国的发病率为9.4%~1
0.4%［1］，其导致的孕产妇死亡约占妊娠相关性死亡的10%。5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）是叶酸代谢途径的催化剂，对DNA甲基化和基因调控具有重要作用［］。研究表明,MTHFR 基因C677T突变位于1号染体（lp36.6）第4外显子，使第222密码子处缬氨酸转化为丙氨酸，可导致血浆叶酸水平下降和同型半胱氨酸（Hey）水平升高［3］。本研究通过分析MTHFR基因C677T多态性、Hcy以及肾功能指标在妊高征患者中的表达，探讨以上指标对妊高征的诊断价值，以期为临床诊疗提供更为可靠的依据，改善不良妊娠结局。
1资料与方法
1.1一般资料选择2018年2月至2019年10月在长宁区妇幼保健院产科住院的妊高征患者86例（疾病组），按中华医学会妇产科学分会妊娠高血压疾病学组发布的《妊娠期高血压疾病诊治指南（2012版）》的相关诊断标准［4］，即妊娠20周以后出现的高血压，收缩压>140mm Hg和（或）舒张压>90mm Hg（2次间隔至少4h,1mm Hg=0.133kPa），同时排除其他妊娠合并疾病，根据病情轻重程度分为妊娠高血压组（30例）、轻度子痫前期组（26例）、重度子痫前期组（30例）3个亚组。妊高征患者年龄21~41岁，平均（31.19土3.93）岁；孕周22~41周，平均（35.91士3. 93）周。随机选择同期到该院产检的健康妊娠女性（正常妊娠组）200例，年龄20~42岁，平均（29.72士3. 34）岁；孕周22~42周，平均（37.18士3.17）周。选择到该院体检的健康非妊娠女性（健康对照组）150例，年龄22〜39岁，平均（30.32士358）岁。所有入选对象均无肝、肾疾病及血栓性疾病，半年内未服用影响凝血功能
的相关药物，均签署知情同意书。本研究经医院伦理委员会批准。
1.2方法嘱受试者空腹10h，采集未抗凝静脉血4mL，分离血清后在西门子ADVIA Chemistry XPT 仪器上采用酶法进行Hey、尿酸（UA）、肌酐（Cr）及尿素氮（BUN）水平检测，具体操作参照仪器配套试剂盒说明书。采集EDTA-K2抗凝血2mL收集白细胞层提取DNA，利用Primer Premier  6.0软件设计MTHFR C677T基因引物序列：正向引物5-GT-GCTGTGCTGTTGGAAGGT-3'，反向弓I物5-TCAGC GAACTCAGCACTCC-3'，从NCBI网站获取健康人的基因序列，预期位置:rsl801133；预期序歹:TTGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGAG［C/T］CGATTTCA TCATCACGCAGCTTTTC。将DNA 标本送上海允晟医学检验所进行基因测序［采用ABI 测序仪（3730X1DNA Analyzer）］，利用Chromas软件分析测序结果，并与健康人序列进行比对，出多态性位点。
1.3统计学处理采用SPSS2
2.0软件对数据进行统计分析。正态分布的计量资料以丄士s表示，组间比较采用t检验，对基因型进行Hardy-Weinberg（H-W）遗传平衡定律检验；采用Spearman相关对MTH­FR C677T基因型与Hcy.UA.Cr及BUN的相关性进行分析。以P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1不同人以及不同严重程度妊高征患者Hey、肾功能指标水平比较与健康对照组、正常妊娠组相比，疾病组Hcy.UA.Cr和BUN水平明显增高，差异均有统计学意义（P<0.05）。与健康对照组相比，正常妊娠组UA水平增高，Hcy、Cr和BUN水平降低，但差异无统计学意义（P>0.05），见表1。与妊娠高血压组、轻度子痫前期组相比，重度子痫前期组Hey、UA、Cr和BUN水平明显增高，差异均有统计学意义（P<0.05）。与妊娠高血压组相比，轻度子痫前期组Hey和UA水平增高，差异有统计学意义（P< 0.05），而Cr和BUN水平虽有增高，但差异无统计学意义（P>0.05），见表2。
2.2MTHFR基因C677T多态性利用Chromas 软件分析测序结果,MTHFR基因C677T有3种基因型:CC基因型、CT基因型、TT基因型。对研究人的基因型分布进行H-W遗传平衡定律检验，送检的86例妊高征患者的基因型分布符合H-W遗传平衡定律（X=0.109,P=0.947），标本具有本区域体
代表性，见图1O
痫前期组、重度子痫前期组基因型及等位基因分布差2. 3 3组不同严重程度妊高征患者MTHFR  C677T
异无统计学意义（P 〉0. 05）见表3。
基因型及等位基因频率分布 妊娠高血压组、轻度子
表1
3组人Hey 、肾功能指标水平比较（x  士 5）
组别 n
Hcy( “mol/L)UA(“mol/L)
Cr(“mol/L)BUN(mmol/L)健康对照组
150  6. 29士 1. 81283. 60士56. 0855. 98士7. 44  4. 47士0. 98正常妊娠组200  6. 02士 1. 89305.71士69.32
53. 81 士6. 89
4. 33士0. 92
疾病组
86
10. 40士2. 87ab
422. 96士87. 65心84. 78士 8. 94 ab 7. 99士 1. 48 ab
注：与健康对照组比较，a P V0.05；与正常妊娠组比较,P V0.05。
表2
3组不同严重程度妊高征患者Hey 、肾功能指标水平比较（x  士 5）注：与妊娠高血压组比较,a P <0. 05；与轻度子痫前期组比较,b P <0. 05。
组别
n
Hcy(“mol/L)
UA(“mol/L)Cr(“mol/L)BUN(mmol/L)
妊娠高血压组307. 89士2. 16368.03士77.1682. 03士 7. 787. 63士0. 94轻度子痫前期组26
9. 74士2. 64a
427.50士82.26a
83. 27士 9. 117. 69士 1. 23重度子痫前期组
30
13. 48士 3. 61ab 473. 96士84. 05ab
88. 83士8. 67ab
8. 62士 1. 61ab
2.4 MTHFR  C677T 基因型与Hey 和肾功能指标 水平的关系 TT 基因型患者的Hey 水平明显高于
CC 、CT 基因型患者，差异有统计学意义（P V0. 05）,
而CC 基因型与CT 基因型患者的Hey 水平比较，差
异无统计学意义（P 〉0. 05） 此外，3种基因型患者
的UA 、&和BUN 水平比较，差异均无统计学意义
（P >0. 05） 通过Spearman 相关分析发现，MTHFR
C677T 基因型与Hey 呈正相关（r  = 0. 418,P  < 0.05）与 UA 、Cr  和 BUN  无相关性（r  = — 0. 111.0. 043、一0. 042,P 〉0. 05），见表 4
。
表33组不同严重程度妊高征患者MTHFR C677T基因型及等位基因分布频率[”（％）]
组别n
基因型等位基因
CC CT TT C T 妊娠高血压组3012(40.0)14(46.7)4(13.3)38(633)22(367)轻度子痫前期组2610(38.4)13(50.0)3(11.5)33(635)19(36.5)重度子痫前期组3014(46.7)11(36.7)5(16.6)39(650)21(35.0)合计8636(41.9)38(442)12(13.9)110(64.0)62(360) X  1.1710044
P0*******
表4MTHFR C677T3种不同基因型患者的Hcy、肾功能指标水平比较（工士s）
基因型n Hey(卜m ol/'L)UA(#m()l/L)Cr(#m()l/L)BUNCmmol/L) CC36924士2.3942060士82648603士8248.07士153 CT38994士261426.71士85.868367士8097.94士1.42 TT1215.34士450心418.17士86.3284.54士8.417.91士1.45注：与CC基因型比较，“P<0.05；与CT基因型比较,b P<0.05。
3讨论
正常情况下，孕6~8周时母体血容量开始增加，至孕32~34周时达到高峰，总循环血量增加40%~ 50%，血液相对稀释。循环血量的增加致使各重要脏器的灌注量增加，孕晚期子宫动脉的横断面积较非孕期增加2~3倍[5]，肾小球滤过率（GFR）和肾血浆流量（ERPF）代偿性升高，使孕期血液中的Cr和BUN 等水平有一定程度的下降。妊高征是妊娠与血压升高并存的一组疾病，是孕晚期产科的常见疾病，在孕20周后出现高血压、水肿和蛋白尿，并且随着病情的加重，其可导致全身多处脏器受累。全身小动脉痉挛和血液高凝是本病主要的病理改变，可导致机体全身脏器有效血流量减少，肾脏供血下降，GFR与ERPF 降低，肾脏代谢UA、Cr和BUN明显减少。本研究发现，与健康对照组、正常妊娠组相比，疾病组UA、Cr 及BUN水平均明显增高；与妊娠高血压组、轻度子痫前期组相比，重度子痫前期组UA、Cr和BUN水平均明显增高（P<0.05）。由此可见，随着病情进展，肾脏失去代偿功能，血液中的肾功能指标水平明显增加，这表明血清UA、Cr及BUN能够作为妊高征的临床辅助诊断指标，以及成为判断疾病严重程度的一类重要参数。
MTHFR是叶酸转运和代谢的关键酶。MTH­FR基因C677T位点和A1298C位点的多态性会造成MTHFR活性降低，造成叶酸代谢异常，并且叶酸水平下降会使Hey水平升高。研究发现，Hey可以促进氧自由基的生成，不仅激活血小板的黏附和聚集，损伤血管内皮细胞，还能刺激血管平滑肌细胞增殖[6]，使血管内胶原成分增加，血管壁增厚，破坏血管顺应性。此外,Hcy还可抑制胱硫醚7裂解酶活性，减少内源性血管舒张剂硫化氢的生成[7]，这些因素可促进妊高征的形成。有研究报道,MTHFR基因A1298C 位点[]多
态性与Hey无相关性。本研究从MTHFR 基因C677T位点入手，发现MTHFR基因C677T多态性与UA、Cr及BUN无相关性（P>0.05），与Hey 有一定的相关性（P<0.05），且TT基因型患者的Hey水平明显高于CC、CT基因型患者（P<0.05）o 妊高征患者Hey水平明显增高（P<0.05），并与病情严重程度呈正相关，与高同型半胱氨酸血症的存在加重妊高征疾病的发展相一致[9]。
综上所述，妊高征患者血清Hey及肾功能指标水平明显增高，且在重症患者中升高更为明显，能够作为妊高征辅助诊断、病情监测及预后判断的重要指标。MTHFR基因C677T多态性和妊高征患者血清Hey水平有一定的相关性，且纯合型（TT基因型）患者血清Hey水平显著增高，检测MTHFR基因C677T多态性可为妊高征患者病情严重程度评估及预后判断提供一定依据。
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ZnT-8A阳性患者总计54例，占80.60%，进一步证明了ZnT-8A在LADA诊断中的重要作用。3组各类胰岛细胞自身抗体阳性率差异无统计学意义(P> 0.05)，说明25(OH)D3水平高低不能影响胰岛细胞自身抗体类别。LADA患者可产生不止一种胰岛细胞自身抗体，部分患者可产生两种甚至两种以上抗体。将3组的胰岛细胞自身抗体数量分为两个级别，经统计分析发现，充足组中1种胰岛细胞自身抗体阳性的比例高于缺乏组，>2种胰岛细胞自身抗体阳性的比例低于缺乏组，差异均有统计学意义(P<0.05)。这说明25(OH)D3水平较低的LADA患者体内，胰岛细胞自身抗体种类越复杂，胰岛细胞损伤越严重。目前25(OH)D3对糖尿病患者胰岛功能的具体作用机制未明，推测可能与抑制炎症或者免疫调节有关。
综上所述，充足组中性粒细胞计数、CRP水平均低于缺乏组，1种胰岛细胞自身抗体阳性的比例高于缺乏组,>2种胰岛细胞自身抗体阳性的比例低于缺乏组，且25(OH)D3水平与WBC、中性粒细胞计数、CRP呈负相关。如果通过饮食、药物提高患者25(OH)D3水平，可能会影响LADA患者炎症因子水平和胰岛细胞自身抗体数量，控制胰岛细胞炎性反应和减少胰岛细胞自身抗体的进一步产生，至于具体的效果和方案需要大样本、双盲、多中心的参与，才能得出科学的结论。
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